通过靶向抑制灰葡萄孢菌致病基因而防治农作物灰霉病的dsRNA药剂及其制备与应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及通过靶向抑制灰葡萄孢菌关键致病基因而防治农作物灰霉病的dsrna药剂及其制备与应用。

背景技术：

1、灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)是一种世界性的植物病原真菌，寄主范围非常广泛，是许多经济上重要的水果、蔬菜和花卉灰霉病的病原，可以攻击200多种植物，每年在全世界造成的经济损失超过100亿美元。由于其广泛的寄主范围和巨大的经济影响，被认为是仅次于稻瘟病的第二大农业重要病原菌。灰葡萄孢菌可直接穿透健康植物组织或通过伤口感染。以菌丝、分生孢子及菌核的形式侵染寄主，作为一种坏死营养型病原体，依靠其杀死植物细胞的能力来建立植物感染并开始寄生生命周期。在受感染植株上或萌发菌核上产生的分生孢子被气流分散到新植株上，分生孢子降落在寄主表面附着后，它们在寄主表面生长并产生芽管，芽管发育为附着胞，有利于渗透寄主表面。

2、目前，主要通过植物叶片喷洒化学药剂来防治灰霉病，此方法虽可高效抑制病害，但灰葡萄孢菌变异频繁的特性，易使其产生高抗药性，防治效果逐渐减弱。使用化学防治手段不仅成本高，残存在环境中的化学药剂可能会危害人畜健康。

3、喷雾诱导的基因沉默(spray-induced gene silencing,sigs)技术是一种新型的基因沉默技术，该技术以病原菌生长发育以及致病相关基因作为靶标，通过喷雾的手段将体外合成的针对靶标基因的dsrna施加于植物体表面，从而抑制靶标基因的表达。sigs技术具有精准靶标、操作便捷、安全无毒的新技术，有效弥补了传统防治方法存在的短板，对农产品安全、环境安全造成的影响得到了极大的控制。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种被精准靶向抑制的灰葡萄孢菌关键致病基因，所述被精准靶向抑制的基因为超氧化物歧化酶基因sod1和短链脱氢酶基因sdr1，其中，核苷酸序列如seq id no.1，seq id no.2所示，进一步通过特定设计被靶向所述基因的dsrna可以达到降低灰葡萄孢致病性从而防治农作物灰霉病的作用，为今后绿色防控灰霉病的生产实践中提供基础。

2、本发明还提供了能够对灰葡萄孢菌致病基因实施精准靶向抑制并降低其致病性的dsrna药剂及其应用。

3、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所述被精准靶向抑制的灰葡萄孢菌关键致病基因为超氧化物歧化酶sod1或短链脱氢酶sdr1中的任意一种，其核苷酸序列如seqid no.1、seq id no.2所示。

4、其中，所述dsrna为能够对超氧化物歧化酶sod1基因实施精准靶向抑制的dsrna或能够对短链脱氢酶sdr1基因实施精准靶向抑制的dsrna中的任意一种，其核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。

5、进一步地，所述能够对超氧化物歧化酶sod1基因实施精准靶向抑制的dsrna或能够对短链脱氢酶sdr1基因实施精准靶向抑制的dsrna，包括其正义链和反义链，其中提供的序列seq id no.3、seq id no.4为其正义链，同时存在对应的反义链；通常dsrna以其正义链表示即可。

6、本发明所述含能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna表达载体。

7、其中，能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna表达载体的构建方法，包括如下步骤：

8、(1)从灰葡萄孢菌中提取总rna，然后反转录成cdna；

9、(2)以步骤(1)所获得的cdna产物为模板，以灰葡萄孢菌基因sod1和sdr1的上下游引物以及sod1-loop和sdr1-loop的上下游引物进行pcr扩增得到sod1-上游和sdr1-上游，sod1-下游和sdr1-下游以及sod1-loop和sdr1-loop；

10、(3)使用overlap pcr先将sod1-上游和sdr1-上游分别与sod1-loop和sdr1-loop相连接得到sod1-上游-loop和sdr1-上游-loop，上述产物与pet-28载体连接；

11、(4)测序正确后使用酶切连接的方法将sod1-上游-loop和sdr1-上游-loop分别与sod1-下游、sdr1-下游连接得到sod1-上游-loop-下游、sdr1-上游-loop-下游的茎环结构，得到表达载体。

12、进一步地，用于扩增所述能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的引物对为sod1-上游-f、sod1-上游-r、sod1-loop-f、sod1-loop-r、sod1-下游-f、sod1-下游-r和sdr1-上游-f、sdr1-上游-r、sdr1-loop-f、sdr1-loop-r、sdr1-下游-f、sdr1-下游-r，其序列如seq id no.7-seq id no.18所示。

13、本发明所述能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的诱导方法具体为：取出重组菌甘油菌涂板至含有氨苄和四环素抗性的lb平板上，24小时后挑取单菌落加入到含有氨苄和四环素抗性的lb液体培养基中，使用iptg诱导后提取总rna，提取后使用酶消化处理去除dna和单链rna，得到纯净的dsrna溶液。

14、本发明所述的能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的递送方法为外源施加法。

15、本发明所述的能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的外源施加法的具体步骤如下：将靶向灰葡萄孢菌关键致病基因的dsrna施加于植物上即可。

16、作为优选，本发明所述的能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的外源施加法的具体步骤如下：将靶向灰葡萄孢菌关键致病基因的dsrna施加于植物叶片或果实上。

17、本发明能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna的外源施加法中所述dsrna混合液配置方法具体如下：

18、(1)使用depc水将dsrna溶解并将浓度调至50ng/μl；

19、(2)将dsrna溶液与施加到需要保护的作物表面。

20、本发明所述的技术包括被精准靶向抑制的灰葡萄孢菌关键致病基因或所述能够对灰葡萄孢菌关键致病基因实施精准靶向抑制的dsrna或所述的表达载体在降低灰葡萄孢菌致病性或者制备降低灰葡萄孢菌致病性药剂中的应用。

21、进一步地，所述降低灰葡萄孢菌致病性药剂包括50ng/ul的ds-sod1或ds-sdr1。

22、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

23、1、本发明首次克隆到全新的双链核糖核酸dsrna，实验室条件下将50ng/μlds-sod1或ds-sdr1与灰葡萄孢菌孢子共孵育后，该dsrna通过rnai诱导标靶基因的沉默，从而降低灰葡萄孢菌孢子萌发率、影响侵染垫形成和菌丝生长，基因沉默效率较高。

24、2、本发明灰葡萄孢菌bc05.10和ds-sod1或ds-sdr1混合处理拟南芥、洋葱、番茄后，处理的叶片在3天后病斑面积明显减小，灰葡萄孢菌关键致病基因的dsrna即ds-sod1或ds-sdr1有望开发成为新型绿色杀菌剂。