一种适于阿达木单抗的表达盒及其载体与应用的制作方法

本发明属于生物。具体地，涉及一种适于阿达木单抗的表达盒及其载体与应用。

背景技术：

1、葡萄膜炎(uveitis)又称色素膜炎，是虹膜、睫状体及脉络膜组织炎症的总称。葡萄膜炎是一种慢性疾病，多发于青壮年，种类繁多，病因相当复杂，治疗不当可导致失明，在致盲眼病中占有重要地位，已引起世界范围内的重视。

2、由于其发病及复发机制尚不完全清楚，故其预防无从着手，治疗效果也很不理想。因此，寻求合理而有效的治疗药物，已成为眼科领域里一个亟待解决的问题。

3、目前葡萄膜炎的一线治疗药物是激素(例如地塞米松)，以及用tnfα抑制剂治疗。但是用tnfα抑制剂治疗，需要全身给药，带来的副作用较大，且1月给1次药会带来依从性差的问题。

4、阿达木单抗是一种抗人肿瘤坏死因子(tnf)的人源化单克隆抗体，为人单克隆d2e7重链和轻链经二硫键结合的二聚物。阿达木单抗可特异性地与tnfα结合并阻断其与p55和p75细胞表面tnf受体的相互作用，具有控制炎症，减少免疫应答等效果，对自身免疫性疾病具有改善作用。然而目前的阿达木单抗价格较为昂贵且表达量还不够高，需要一种可以提高阿达木单抗表达量的方法以降低其工业生产成本，从而降低用药成本使患者受益。

5、因此，本领域迫切需要开发一种适于阿达木单抗的表达盒或表达载体以提高阿达木单抗表达量。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供一种适于阿达木单抗的表达盒及其载体与应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5'-3'端包括式i或式ii所示的结构：

3、x0-x1-x2-x3-x4-x5-x6(i)

4、x0-x4-x2-x3-x1-x5-x6(ii)

5、式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

6、x0为调控元件；

7、x1为阿达木单抗重链编码序列；

8、x2为无或酶切位点；

9、x3为无或自剪切肽；

10、x4为阿达木单抗轻链编码序列；

11、x5为无或wpre元件；

12、x6为poly(a)信号肽。

13、在另一优选例中，所述阿达木单抗重链编码序列选自下组：

14、(1)如seq id no:1所示的序列；或者

15、(2)在seq id no:1所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸得到的，且不改变其编码的氨基酸序列的保守性衍生序列。

16、在另一优选例中，所述阿达木单抗轻链编码序列选自下组：

17、(1)如seq id no:2所示的序列；或者

18、(2)在seq id no:2所示序列的基础上经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个核苷酸得到的，且不改变其编码的氨基酸序列的保守性衍生序列。

19、在另一优选例中，所述保守性衍生序列与seq id no:1或seq id no:2所示的序列具有至少90％，优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

20、在另一优选例中，所述调控元件选自下组：增强子元件、启动子元件、内含子元件，或其组合。

21、在另一优选例中，所述增强子元件为cmv增强子，其序列如seq id no:3所示。

22、在另一优选例中，所述启动子元件选自下组：cmv启动子、cba启动子、cag启动子、cbh启动子、ef-1α启动子，或其组合。

23、在另一优选例中，所述启动子元件为cba启动子，其序列如seq id no:4所示。

24、在另一优选例中，所述内含子元件选自下组：sv40内含子、嵌合内含子，或其组合。

25、在另一优选例中，所述嵌合内含子的序列如seq id no:5所示。

26、在另一优选例中，所述酶切位点选自下组：furin酶切位点、furin酶切位点-gsg，或其组合。

27、在另一优选例中，所述酶切位点为furin酶切位点，其序列如seq id no:13-15中任一项所示。

28、在另一优选例中，所述自剪切肽选自下组：f2a、p2a、t2a、e2a，或其组合；较佳地，所述自剪切肽选自：f2a、p2a，或其组合。

29、在另一优选例中，所述wpre元件包括wpre序列或其片段、wpre变体序列或其片段。

30、在另一优选例中，所述wpre元件为wpre3，其序列如seq id no:19所示。

31、在另一优选例中，所述wpre序列片段具有如seq id no:20所示的核苷酸序列。

32、在另一优选例中，所述poly(a)信号肽选自下组：bgh poly(a)信号肽、sv40poly(a)信号肽、ks13 poly(a)信号肽，或其组合。

33、在另一优选例中，所述poly(a)信号肽为bgh poly(a)信号肽，其序列如seq idno:6所示。

34、在另一优选例中，所述poly(a)信号肽为sv40 poly(a)信号肽，其序列如seq idno:7所示。

35、在另一优选例中，所述poly(a)信号肽为ks13 poly(a)信号肽，其序列如seq idno:8所示。

36、在另一优选例中，所述表达盒从5'-3'端具有式a所示的结构：

37、z0-z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z8-z9-z10-z11-z12(a)

38、式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

39、z0为无或itr-l序列；

40、z1为增强子元件；

41、z2为启动子元件1；

42、z3为内含子元件；

43、z4为seq id no:1；

44、z5为无或酶切位点；

45、z6为无或自剪切肽；

46、z7为seq id no:2；

47、z8为无或wpre元件；

48、z9为poly(a)信号肽；

49、z10为无或itr-r序列；

50、z11为无或启动子元件2；和

51、z12为无或任选的标签序列。

52、在另一优选例中，所述z0的序列如seq id no:9或seq id no:11所示。

53、在另一优选例中，所述z1为cmv增强子，其序列如seq id no:3所示。

54、在另一优选例中，所述z2选自下组：cmv启动子、cag启动子、cbh启动子、ef-1α启动子、cba启动子，或其组合。

55、在另一优选例中，所述z2为cba启动子，其序列如seq id no:4所示。

56、在另一优选例中，所述z3选自下组：sv40内含子、嵌合内含子，或其组合。

57、在另一优选例中，所述z3为嵌合内含子，其序列如seq id no:5所示。

58、在另一优选例中，所述z5选自下组：furin酶切位点、furin酶切位点-gsg，或其组合。

59、在另一优选例中，所述z5为furin酶切位点，其序列如seq id no:13-15中任一项所示。

60、在另一优选例中，所述z6选自下组：f2a、p2a、t2a、e2a，或其组合；较佳地，所述自剪切肽选自：f2a、p2a，或其组合。

61、在另一优选例中，上述“z5-z6”为furin酶切位点-gsg-p2a肽，其具有如seq idno:18所示的氨基酸序列。

62、在另一优选例中，所述z8包括wpre序列或其片段、wpre变体序列或其片段。

63、在另一优选例中，所述z8为wpre3，其序列如seq id no:19所示。

64、在另一优选例中，所述z8为wpre序列片段，其具有如seq id no:20所示的核苷酸序列。

65、在另一优选例中，所述z9选自下组：bgh poly(a)信号肽、sv40 poly(a)信号肽、ks13 poly(a)信号肽，或其组合。

66、在另一优选例中，所述z9为bgh poly(a)信号肽，其序列如seq id no:6所示。

67、在另一优选例中，所述z9为sv40 poly(a)信号肽，其序列如seq id no:7所示。

68、在另一优选例中，所述z9为ks13 poly(a)信号肽，其序列如seq id no:8所示。

69、在另一优选例中，所述z10的序列如seq id no:10或seq id no:12所示。

70、在另一优选例中，所述z11为氨苄青霉素抗性基因(ampr)启动子。

71、在另一优选例中，所述标签包括抗性标记和/或荧光素标记。

72、在另一优选例中，所述z12为卡那霉素抗性基因(kanr)。

73、在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为0-30nt，较佳地1-15nt。

74、在另一优选例中，所述表达盒从5'-3'端具有式ai所示的结构：

75、z0-z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z9-z10-z11-z12(ai)

76、式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

77、z0-z4具有如上所述定义；

78、z5为furin酶切位点；

79、z6为p2a或f2a；

80、z7-z8具有如上所述定义；

81、z9为bgh poly(a)信号肽；

82、z10-z12具有如上所述定义。

83、在另一优选例中，所述表达盒选自下组：表达盒g005、表达盒g1075、表达盒g1104、表达盒g29、表达盒g1137、表达盒g1138、表达盒g1139、表达盒g1146；

84、其中，所述表达盒g005具有如seq id no:21所示的核苷酸序列；

85、所述表达盒g1075具有如seq id no:22所示的核苷酸序列；

86、所述表达盒g1104具有如seq id no:23所示的核苷酸序列；

87、所述表达盒g29具有如seq id no:24所示的核苷酸序列；

88、所述表达盒g1137具有如seq id no:25所示的核苷酸序列；

89、所述表达盒g1138具有如seq id no:26所示的核苷酸序列；

90、所述表达盒g1139具有如seq id no:27所示的核苷酸序列；

91、所述表达盒g1146具有如seq id no:28所示的核苷酸序列。

92、在另一优选例中，所述表达盒具有选自下组的核苷酸序列：

93、(a)如seq id no:21-28中任一项所示的核苷酸序列；

94、(b)与seq id no:21-28中任一项所示序列的同一性≥95％(较佳地≥98％)的核苷酸序列；或

95、(c)在如seq id no:21-28中任一项所示序列的5'端和/或3'端截短或添加1-30个(较佳地1-15个，更佳地1-9个)核苷酸的序列。

96、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的表达盒。

97、在另一优选例中，所述核酸分子可为rna、dna或cdna。

98、在另一优选例中，所述核酸分子的序列与seq id no:21-28中任一项所示的序列具有至少50％的同一性，优选地具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

99、在另一优选例中，所述核酸分子具有选自下组的核苷酸序列：

100、(a)如seq id no:21-28中任一项所示的核苷酸序列；

101、(b)与seq id no:21-28中任一项所示序列的同一性≥95％(较佳地≥98％)的核苷酸序列；或

102、(c)在如seq id no:21-28中任一项所示序列的5'端和/或3'端截短或添加1-30个(较佳地1-15个，更佳地1-9个)核苷酸的序列。

103、在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第一方面所述的表达盒。

104、在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。

105、在另一优选例中，所述表达载体包括质粒载体。

106、在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、逆转录病毒载体，或其组合；较佳地，所述表达载体为aav载体。

107、在另一优选例中，所述aav载体包括：

108、(i)aav-y659的aav衣壳蛋白；和

109、(ii)包装在所述aav衣壳蛋白中的如本发明第一方面所述的表达盒或如本发明第二方面所述的核酸分子。

110、在另一优选例中，所述aav-y659的aav衣壳蛋白具有如seq id no:30所示的氨基酸序列。

111、在另一优选例中，所述aav-y659的aav衣壳蛋白的编码序列如seq id no:31所示。

112、在另一优选例中，所述aav载体的rep基因可源自任选的aav血清型。

113、在另一优选例中，所述aav血清型包括但不限于：aav1、aav2、aav2.7m8、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aavrh10。

114、在另一优选例中，所述aav载体的rep基因源自aav2。

115、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第二方面所述的核酸分子。

116、在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

117、在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

118、在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

119、在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：hek细胞、视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、网间细胞、muller细胞、色素上皮细胞、节细胞。

120、在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

121、(i)如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体，或如本发明第四方面所述的宿主细胞，作为活性成分；和

122、(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

123、在另一优选例中，所述组分(i)占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，较佳地10-99.9wt％，更佳地70-99wt％。

124、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：冻干剂型、液态剂型。

125、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

126、在另一优选例中，所述药物组合物的施用部位包括眼周、玻璃体腔内、脉络膜上或视网膜下。

127、在另一优选例中，所述药物组合物是用于视网膜下腔注射或玻璃体腔注射的注射剂型。

128、在另一优选例中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

129、在另一优选例中，所述药学上可接受的载体为注射剂载体，较佳地，所述药学上可接受的载体包括盐水，所述盐水包括但不限于：缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液、聚山梨醇酯溶液，或其组合。

130、在另一优选例中，所述药学上可接受的载体可进一步包含添加剂，所述添加剂包括但不限于：稳定剂、防腐剂、有助于细胞摄取的转染促进剂，或其组合。

131、在另一优选例中，所述药物组合物在治疗视网膜相关疾病或自身免疫疾病的应用中，可单独使用或联合使用。

132、在另一优选例中，所述联合使用包括：与其他治疗视网膜相关疾病或自身免疫疾病的药物联合使用。

133、在另一优选例中，所述其他治疗视网膜相关疾病的药物包括：糖皮质激素(如强的松、地塞米松等)、阿托品、肾上腺素、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环孢霉素，或其组合。

134、在另一优选例中，所述其他治疗自身免疫疾病的药物包括：依那西普单抗、英夫利昔单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗。

135、在本发明的第六方面，提供了一种如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于给需要的对象预防和/或治疗阿达木单抗适用的适应症。

136、在另一优选例中，所述阿达木单抗适用的适应症包括但不限于：视网膜相关疾病、自身免疫疾病。

137、在另一优选例中，所述视网膜相关疾病选自下组：葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿、湿性(新生血管性、渗出性)年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变、色素性视网膜炎、视网膜毛细血管扩张、视网膜和/或脉络膜新生血管形成、新生血管性青光眼、继发于视网膜疾病的角膜和/或虹膜新生血管形成，或其组合。

138、在另一优选例中，所述视网膜静脉阻塞包括：分支视网膜静脉阻塞、半侧性视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞。

139、在另一优选例中，所述视网膜和/或脉络膜新生血管形成包括继发于视网膜疾病的视网膜和/或脉络膜新生血管形成、创伤引起的视网膜和/或脉络膜新生血管形成、特发性视网膜和/或脉络膜新生血管形成。

140、在另一优选例中，所述继发于视网膜疾病的视网膜和/或脉络膜新生血管形成继发于包括但不限于选自下组的视网膜疾病：葡萄膜炎、视网膜静脉阻塞、视网膜变性病症、遗传性视网膜和/或脉络膜疾病、眼睛肿瘤。

141、在另一优选例中，所述视网膜相关疾病为tnfα高表达的视网膜相关疾病，其中所述tnfα高表达指炎症组织或炎症细胞中的tnfα表达量e1与正常组织或正常细胞中的tnfα表达量e0之比(即e1/e0)≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

142、在另一优选例中，所述炎症组织包括但不限于：虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜、晶状体、角膜。

143、在另一优选例中，所述炎症细胞包括但不限于：视杆细胞、视锥细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、网间细胞、muller细胞、色素上皮细胞、节细胞。

144、在另一优选例中，所述视网膜相关疾病包括但不限于葡萄膜炎。

145、在另一优选例中，所述自身免疫疾病包括但不限于：强直性脊椎炎、类风湿关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、斑块型银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩病(包括儿童克罗恩病)、化脓性汗腺炎。

146、在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。

147、在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括但不限于：非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、大鼠、小鼠等。

148、在另一优选例中，所述制剂或组合物的施用部位包括眼周、玻璃体腔内、脉络膜上或视网膜下。

149、在另一优选例中，所述制剂或组合物通过玻璃体腔注射施用。

150、在本发明的第七方面，提供了一种疾病预防和/或治疗方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的表达盒、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的表达载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的药物组合物。

151、在另一优选例中，所述疾病包括但不限于：视网膜相关疾病、自身免疫疾病，或其组合。

152、在另一优选例中，所述施用的部位包括眼周、玻璃体腔内、脉络膜上或视网膜下。

153、在另一优选例中，所述施用的方式为玻璃体腔注射。

154、在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

155、在另一优选例中，所述表达载体为aav载体。

156、在另一优选例中，所述aav载体中，aav-y659的使用剂量为2e+9-1e+13vg，较佳地为1e+10-2e+12vg，更佳地为5e+10-2e+11vg。

157、在另一优选例中，所述方法可与其他治疗方法联合使用。

158、在本发明的第八方面，提供了一种产生阿达木单抗或其抗原结合片段的方法，包括步骤：

159、(a)在适合的条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含有阿达木单抗或其抗原结合片段的培养物；

160、(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的阿达木单抗或其抗原结合片段；和

161、(c)任选地，对步骤(b)获得的阿达木单抗或其抗原结合片段进行纯化和/或修饰。

162、在本发明的第九方面，提供了一种在视网膜特异性表达阿达木单抗的方法，所述方法包括步骤：

163、(z1)提供一aav载体，所述aav载体包括如本发明第一方面所述的表达盒或如本发明第二方面所述的核酸分子；和

164、(z2)使用所述aav载体对视网膜进行感染，从而在所述视网膜特异性表达阿达木单抗。

165、在另一优选例中，所述aav载体包括但不限于：aav1、aav2、aav2.7m8、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aavrh10。

166、在另一优选例中，所述aav载体包括：

167、(i)aav-y659的aav衣壳蛋白；和

168、(ii)包装在所述aav衣壳蛋白中的如本发明第一方面所述的表达盒或如本发明第二方面所述的核酸分子。

169、在另一优选例中，所述aav-y659的aav衣壳蛋白具有如seq id no:30所示的氨基酸序列。

170、在另一优选例中，所述aav-y659的aav衣壳蛋白的编码序列如seq id no:31所示。

171、在另一优选例中，所述方法为体外方法。

172、在另一优选例中，所述方法为非诊断目的、非治疗目的。

173、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。