一种锈菌菌株、其筛选和鉴定方法及其应用

本发明属于微生物应用于农业植物保护、防除杂草的，具体涉及一种锈菌菌株、其筛选和鉴定方法及其应用。

背景技术：

1、柔枝莠竹(microstegium vimineum(trin.)a.camus)是一种原产于亚洲的高度入侵的禾本科一年生草本c4植物，柔枝莠竹茎秆纤细，下部平卧，上部直立，长可达1.5m，多分枝，叶片线状披针形或披针形，两面均疏生柔毛，花果期为8-11月，可产生气生根，种子量很大且种子活力较高，可在土壤中持续5年之久，适应环境的能力强。原产于东亚的中国、日本、韩国，东南亚的马来西亚，南亚的印度以及高加索山脉地区，在中国分布很广，主要分布在长江流域及以南地区。从1919年首次在自然分布区外的美国田纳西州诺克斯维尔附近发现了柔枝莠竹后，其迅速在美国东南部传播，由于其强入侵性且喜湿耐阴的特点现已入侵到北美、欧洲和澳洲等地，现已成为美国最严重的外来入侵物种之一，严重威胁了当地的生态环境及物种。美国为了防除这种强入侵性的杂草柔枝莠竹，采取了物理、机械、化学等方法，甚至综合几种方法进行防除，但是，长期的防效不是很明显，主要是这些防除方法成本较高，且还存在环境隐患，因此，还是未能达到预期有效防除的结果。在此情况下，生物防治成为一种最有潜力的防除途径，其方法是指利用不利于杂草生长的生物天敌，包括某些病原微生物、节肢动物、食草动物、其他高等植物或生物代谢产物来控制杂草的发生、繁殖和危害。

2、杂草的经典生物防治是指从杂草原产地直接引进其天敌来防治入侵地的杂草种群。1972年澳大利亚从欧洲引进柄锈菌属灯心草粉苞苣柄锈菌(puccinia chondrillinabub.&syd.)来防治杂草灯心草粉苞苣(chondrilla juncea l.)，在田间小区试验时这种锈菌对其致死率达到了90％以上，这在国际上是首例。中国研究者吕国忠等(2004)在三裂叶豚草上发现了苍耳柄锈菌三裂叶豚草专化型(puccinia xanthii schweinf.sp.ambrosiae-trifidae)，对三裂叶豚有较强的致病性。曲波等通过对10科35种杂草、作物接种测试，发现该锈菌只侵染三裂叶豚草，不侵染豚草及其他供试植物，该锈菌的寄主专化型很强，因此，可用来防治三裂叶豚草。条锈菌披碱草专化型(puccinia striiformiswestendrp f.sp.tritici)只侵染其寄主披碱草，接种后20天即可产生大量的夏孢子，对小麦无害。蓟柄锈菌(puccinia obtegens(link)tul.)是一种从小蓟上分离得到的病原菌，侵染小蓟后有良好的防效，这种病原锈菌具有开发为生物除草剂的潜在价值。王旭等首次在羊草上发现披碱草柄锈菌(puccinia elymi westendorp)。引起早熟禾锈病的冠锈菌(puccinia coronate corda var.cummins)，其夏孢子人工接种于活体早熟禾上9-14天后，便会在早熟禾上产生孢子。付卫东等发现薇甘菊柄锈菌(puccinia spegazzinii de toni)的寄主主要局限在薇甘菊还及其同属植物假泽兰，专化性较强，其冬孢子接种于薇甘菊45天后发病率为88％，有望成为防治薇甘菊的一种选择。印度研究者利用柄锈菌属锈菌(puccinia romagnoliar lamane)防除桑树地里的杂草香附子。

3、利用柔枝莠竹的致病性天敌进行生物防治，首先需要系统调查及筛选出它的自然致病天敌。目前国内外研究者已从柔枝莠竹上分离得到25种致病真菌，其中包括5种病原锈菌，有不全层锈菌(phakopsora incomplete(syd.&p.syd.)cummins)、本格特柄锈菌(puccinia benguetensis h.sydow)、莠竹柄锈菌(puccinia polliniae syd.)、莠竹生柄锈菌(puccinia polliniicola sdy.)和白蜡树筛孔锈菌(macruropyxis fraxini(komarov)azbukina)，另外还发现以柔枝莠竹为食的昆虫水蜡虫(胸喙亚目：粉蚧科)。但是，可以用来有效控制该草的天敌十分有限，其中有些致病真菌还会严重危害农作物。因此，在原产地开展柔枝莠竹锈菌的调查与筛选，对在原产地和入侵地防治柔枝莠竹具有重要的理论及应用价值。目前国内已有薇甘菊柄锈菌、玉米多堆柄锈菌、蓟柄锈菌、苍耳柄锈菌三裂叶豚草专化型的专利，尚无锈菌莠竹生柄锈菌的申报，也没有其应用在作物田、草坪、林下、路边、水边、湿地等人工生境或半自然环境防除柔枝莠竹的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对作物田、茶园、果园、草坪、林下、路边、水边和湿地的禾本科杂草柔枝莠竹筛选锈菌，因此本发明提供一种锈菌菌株、其筛选和鉴定方法及其应用，该菌株用于生物除草，高效、环保，成本低，无污染，对农作物安全，除草效果明显。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种锈菌菌株，所述菌株为莠竹生柄锈菌(puccinia polliniicola)菌株wz-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.41065。

4、优选地，所述菌株的形态特征如下：夏孢子堆生于叶片两面或者茎秆上，黄至橙黄色，散生或聚生，圆形或卵球形，裸露，粉末状，直径0.5-1.0mm，常有破裂的寄主表皮围绕；夏孢子单胞，圆形或椭圆形或倒卵形，19-25×15-20μm，具大量小刺，侧壁厚1.5-2.5μm，顶壁厚5-7μm；冬孢子堆生于叶两面和茎秆，黑褐色，垫状，散生，圆形，直径0.2-2.5mm，裸露，常有破裂的寄主表皮围绕；冬孢子双胞，宽长圆形至棒状，上面圆形，下面渐狭，26-36×15-22μm，在隔膜处稍缩，侧壁厚1-5.5μm，顶壁厚4.5-7μm，分生孢子梗呈透明或橙黄色，长度可达115μm。

5、一种锈菌菌株的筛选和鉴定方法，包括以下步骤：

6、步骤1)挑取野外条件下柔枝莠竹叶表面和茎秆上附着的孢子堆，采用真菌gdna提取试剂盒提取dna，分别利用its序列、lsu序列、ssu序列、coiii序列进行pcr扩增，其通用引物分别为its1f&its4b、rust 2inv&lr6、ns1&rust 18sr、coiii f1&coiii r1，分别具有如seq id no.1-8所示的核苷酸序列；

7、步骤2)将步骤1)得到的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pmd19载体，转化大肠杆菌dh5α，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液；

8、步骤3)对步骤2)制得的菌液进行测序，所测结果在genbank中核酸数据库的its、lsu、ssu和coiii相关序列进行同源性比较；

9、步骤4)经扩增测序比对后，its扩增序列与puccinia mysuruensis菌株hsz2119的同源性为90.21％，lsu扩增序列与puccinia sparganioidis菌株ld1004的同源性为95.29％，ssu扩增序列与披碱草柄锈菌puccinia elymi菌株ywnfa22、ywnaa21、ywnba22、ywl2a2和l2a1的同源性为97.43％，coiii扩增序列与萱草柄锈菌pucciniahemerocallidis菌株brip53476的同源性为96.08％，虽同源性均低于99％，应鉴定菌株wz-1为柄锈菌属真菌，但同源性大于或等于99％，视为与菌株wz-1同种；

10、步骤5)通过形态学比较和查阅文献，进一步确定菌株wz-1的种类，最终鉴定菌株wz-1为柄锈菌属莠竹生柄锈菌(puccinia polliniicola)。

11、上述的莠竹生柄锈菌菌株在生物除草中的应用。

12、优选地，利用所述莠竹生柄锈菌菌株的分生孢子的浓度为每毫升105个以上，接种于作物田、果园或草坪的目标杂草上；或将感染所述莠竹生柄锈菌菌株的盆栽柔枝莠竹病害植株置于目标杂草种群中，按每公顷20盆的密度投放。

13、优选地，所述杂草为禾本科杂草柔枝莠竹。

14、优选地，所述作物田的作物包括大豆、水稻、玉米、小麦、大麦、粱、稷、粟、高粱、棉花、花生、甘薯、马铃薯、烟草、燕麦、薏米、绿豆、芝麻、蚕豆、豌豆、豇豆、向日葵、油菜、白菜、青菜、菠菜、番茄、茄、紫苏、茶；所述果园的果树包括桃、梨、梅、柑橘、菠萝、荔枝、龙眼；所述草坪的草本植物包括黑麦草、高羊茅、结缕草、假俭草、早熟禾。

15、一种生物除草剂，包括上述的莠竹生柄锈菌菌株，以及农药学上可接受的载体。

16、优选地，还包括表面活性剂、稳定剂，所述表面活性剂为吐温20或吐温80，所述稳定剂为抗氧化剂。

17、本发明的有益效果如下：

18、(1)本发明的莠竹生柄锈菌菌株为柔枝莠竹专化型菌剂，用于生物除草可以在作物与禾本科杂草间进行安全地选择。本发明的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。在供试的20科79种植物中，包括37种作物、5种草坪草、37种杂草，其中敏感的仅有柔枝莠竹1种，稍敏感的有4种，不敏感的有74种，其中有敏感性的植物均为禾本科，对于其他科植物如豆科、十字花科、胡麻科、部分禾本科等植物均安全。因此该菌株可用于大豆、水稻、玉米、小麦、大麦、粱、稷、粟、高粱、棉花、花生、甘薯、马铃薯、烟草、燕麦、薏米、绿豆、芝麻、蚕豆、豌豆、豇豆、向日葵、油菜、白菜、青菜、菠菜、番茄、茄、紫苏等作物田，茶园，和桃、梨、梅、柑橘、菠萝、荔枝、龙眼等果园，及黑麦草、高羊茅、结缕草、假俭草、早熟禾等草坪，用于控制农田、林下、荒地、路边、水边、湿地、草坪以及其他生境下的杂草柔枝莠竹。

19、(2)本发明的莠竹生柄锈菌菌株用于生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于自然环境，是目标作物田及其环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故没有在使用过程中的生态风险，加之该菌株专化性强，对作物及其它非目标植物安全性高，不会导致对环境的残留危害，其菌体死亡后迅速腐化降解，降解产物均为可循环有机物，不会导致污染，因而对环境安全，可用于生产出绿色或有机农产品。

20、(3)本发明的莠竹生柄锈菌菌株对目标杂草控制效果可以达到80％以上，可在苗期和成熟期的柔枝莠竹叶片上大量传播，导致严重侵染。

21、(4)根据测试，本发明的莠竹生柄锈菌菌株对大多数作物安全，在作物田、茶园、果园、草坪、林下、荒地、路边、湿地等生境下均可以安全使用，并能用于控制上述田间禾本科杂草柔枝莠竹。这再次表明菌株wz-1具有开发为防除柔枝莠竹生物除草剂的潜力。