一种响应缺氧环境控制目的基因表达的系统及其用途的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种响应缺氧环境控制目的基因表达的系统及其在制备治疗乏氧性疾病，例如癌症的药物中的用途。

背景技术：

1、溶瘤病毒介导的免疫疗法是继三大常规治疗方法(手术、放疗和化疗)以及免疫治疗之后的又一重要的新兴肿瘤治疗策略。其他肿瘤免疫疗法，例如细胞免疫治疗的费用高昂，而且难以解决细胞免疫治疗通用性的问题。与之相比，溶瘤病毒具有杀伤效率高、靶向性好、不良反应小、杀伤肿瘤途径多样、耐药性低以及成本低廉等优势。已有研究显示，溶瘤病毒可以应用于不同类型的肿瘤或者不同进展阶段的肿瘤，甚至可以提高转移性或无法治愈的癌症患者的总生存率。对于晚期癌症病人，溶瘤病毒疗法被认为是挽救生命重要的手段之一，而且溶瘤病毒治疗能够诱导肿瘤完全消退或缓解。目前，溶瘤病毒疗法正受到人们的广泛关注，在肿瘤的治疗方面具有十分广阔的前景。

2、上世纪初，溶瘤病毒疗法开始被引入癌症治疗策略中。发展至今，溶瘤病毒已经由最初不经基因修饰的初代产品，即直接利用野生病毒株或者减毒野生病毒株，比如呼肠孤病毒和新城疫病毒等，发展到基因改造的病毒株的研发阶段。经过基因重组从而能在肿瘤细胞内进行增殖的病毒主要有单纯疱疹病毒、腺病毒、麻疹病毒以及牛痘病毒等，而且已经迭代升级到了第三代全新的强效溶瘤病毒，即基因插入及联合治疗增效阶段，这也是目前临床阶段中溶瘤病毒的主要研究方向。

3、然而，在近百年的发展过程中，由于溶瘤病毒自身的限制、肿瘤组织的异质性和肿瘤细胞的复杂性，虽然已经有多款溶瘤病毒药物上市，但是治疗效果甚微，而且单独给药的效果也难以到达临床预期，因此其应用开始受到质疑，这极大限制了溶瘤病毒在实体瘤中的临床应用。目前改进的策略是改造溶瘤病毒基因或者其运载方式，使其适应患者机体系统并且特异性激活免疫系统，实现对肿瘤的定向杀伤；或者采用溶瘤病毒与pd-1、ctla-4等免疫检查点抑制剂的联用，借助溶瘤病毒打破肿瘤组织微环境，使pd-1、ctla-4等免疫检查点抑制剂能够更好地发挥作用。

4、溶瘤病毒疗法面临的巨大挑战不仅在于如何找到高敏感性病毒种类和与之相匹配的适应症，另一个挑战还来自于病毒本身。溶瘤病毒作为身体的异源病原体，无论如何削减病毒活性，都不可避免地会引发机体的免疫反应。需要通过一些安全的调控机制，保障溶瘤病毒最大程度上在肿瘤细胞内复制，而在正常细胞内不复制，在提高肿瘤靶向特异性的同时，其安全性也要得到保障。

5、实体瘤相对缺氧的肿瘤微环境是基因治疗的理想靶点，可以通过缺氧信号使得溶瘤病毒仅在肿瘤组织中复制进行肿瘤杀伤，从而提升肿瘤治疗的特异性，避免或减少对正常组织的损伤。已有研究表明，在缺氧条件下，细胞核产生的缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，hif-1)表达水平升高，其与靶基因的结合增加，促进靶基因转录，从而引起细胞的一系列针对缺氧的反应。现已发现的hif-1的靶基因有60多种，它们都具有缺氧反应元件(hypoxia responsive element，hre)。hre由hif1结合点(共有序列为5’-tacgtgct-3’)和两侧的功能序列构成。hif1结合点突变导致基因对缺氧敏感的转录反应丧失。因此，可以利用缺氧反应元件作为启动表达的控制元件。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种响应缺氧环境控制目的基因的转录和表达的系统，该系统通过缺氧敏感的人工转录因子在常氧环境下经诱导而高效表达，在缺氧环境下表达被抑制，保证了该系统的缺氧敏感性；而缺氧环境下诱导的人工转录因子低水平表达解除了对目的基因的抑制，从而启动目的基因的高效转录和表达，实现缺氧环境下目的基因的靶向递送，避免系统性给药引起的严重毒副作用。通过该种转录表达调控系统，可以增强药物的安全性，但不影响其有效性。本发明还提供了该缺氧敏感的转录表达调控系统的应用，其可通过接入不同的目的基因来制备治疗如实体瘤等缺氧性疾病的药物。

2、一方面，本发明提供一种响应缺氧环境控制目的基因表达的系统，其包含彼此分开的或融合的编码缺氧感应单元的基因和编码目的基因表达单元的基因，其中所述编码缺氧感应单元的基因包含经由编码病毒转录启动子(virus transcription promoter，vtp)的基因连接的编码缺氧反应元件(hypoxia response element，hre)的基因和编码人工转录因子(artificial transcription factor，atf)的基因，以及所述编码目的基因表达单元的基因包含经由编码病毒转录启动子的基因连接的编码人工转录因子识别元件(artificial transcription factor recognition element，atfre)的基因和目的基因(gene of interest，goi)。

3、在本发明中，所述缺氧环境是指氧含量低于2％的细胞或组织。肿瘤组织和细胞对氧和葡萄糖等能量物质的需求量很大，随着肿瘤组织供血不足随之出现肿瘤细胞和组织的缺氧，其细胞和组织氧含量往往低于2％。

4、根据本发明的一些实施方式，所述编码vtp的基因与编码hre的基因之间、以及所述编码vtp的基因与编码atf的基因之间包含编码接头的基因。编码接头的基因的核苷酸序列为随机序列，一般为10-20bp大小。

5、根据本发明的一些实施方式，所述编码vtp的基因与编码atfre的基因之间、以及所述编码vtp的基因与goi之间包含编码接头的基因。编码接头的基因的核苷酸序列为随机序列，一般为10-20bp大小。

6、根据本发明的一些实施方式，所述编码hre的基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，或者为多于1个、优选3个、更优选5个如seq idno：1所示的核苷酸序列的重复核苷酸序列。

7、根据本发明的一些实施方式，所述vtp选自pe/l、截短型pe/l(pe/l-l)、再次截短型pe/l(pe/l-s)、p7.5、截短型p7.5(p7.5-71)、再次截短型p7.5(p7.5-24)、ltrminip或p11中的一种或多种。

8、根据本发明的一些具体实施方式，所述pe/l的核苷酸序列如seq idno：2所示；所述pe/l-l的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述pe/l-s的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述p7.5的核苷酸序列如seq idno：5所示；所述p7.5-71的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述p7.5-24的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述ltrminip的核苷酸序列如seqid no：8所示；所述p11的核苷酸序列如seq id no：37所示。

9、根据本发明的一些实施方式，所述编码atf的基因选自去核定位信号(dnls)的cre基因、去核定位信号的cre-vp64基因、去核定位信号的cre-vp64-odd基因、去核定位信号的cre-rap94基因、去核定位信号的cre-rap94-odd基因或去核定位信号的cre-vp160基因中的一种或多种，优选为去核定位信号的cre-vp64基因。

10、根据本发明的一些具体实施方式，所述去核定位信号的cre基因的核苷酸序列如seq id no：21所示(对应的氨基酸序列如seq id no：22所示)；所述去核定位信号的cre-vp64基因的核苷酸序列如seq idno：23所示(对应的氨基酸序列如seq id no：24所示)；所述去核定位信号的cre-vp64-odd基因的核苷酸序列如seq id no：25所示(对应的氨基酸序列如seq id no：26所示)；所述去核定位信号的cre-rap94基因的核苷酸序列如seq id no：27所示(对应的氨基酸序列如seq id no：28所示)；所述去核定位信号的cre-rap94-odd基因的核苷酸序列如seq id no：29所示(对应的氨基酸序列如seq id no：30所示)；所述去核定位信号的cre-vp160基因的核苷酸序列如seq idno：31所示(对应的氨基酸序列如seq idno：32所示)。

11、根据本发明的一些实施方式，所述编码atfre的基因为一个或多个loxp基因。

12、根据本发明的一些具体实施方式，所述编码atfre的基因的核苷酸序列为多于1个、优选3个、更优选5个、进一步优选6个loxp基因的重复基因序列，例如seq id no：20所示的核苷酸序列。

13、根据本发明的一些实施方式，所述goi选自共刺激分子、细胞因子、负调分子及信号通路的阻断抗体、趋化因子或杀伤分子中的一种或多种，优选为杀伤分子，更优选为bite的编码基因中的一种或多种。

14、根据本发明的一些具体实施方式，所述goi为αcd47-αcd3-bite和/或αigf1r-αcd3-bite。

15、根据本发明的一些优选实施方式，所述缺氧感应单元的组成为5*seq id no：1-编码vtp的基因-dnls-cre-vp64基因，和/或所述目的基因表达单元的组成为seq id no：20-编码vtp的基因-goi。更优选地，所述缺氧感应单元的组成为5*seq id no：1-编码pe/l的基因-dnls-cre-vp64基因，和/或所述目的基因表达单元的组成为seq id no：20-编码p7.5的基因-goi。更优选地，所述缺氧感应单元的组成为5*seq idno：1-编码pe/l的基因-dnls-cre-vp64基因，和/或所述目的基因表达单元为seq id no：20-编码p11的基因-goi。

16、根据本发明的一些实施方式，根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统包含：

17、包含所述编码缺氧感应单元的基因的第一载体和包含所述编码目的基因表达单元的基因的第二载体。

18、根据本发明的一些实施方式，根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统包含一种载体，所述载体包含融合的所述编码缺氧感应单元的基因和所述编码目的基因表达单元的基因。

19、根据本发明的一些实施方式，所述载体选自puc18、puc19、puc57、pcdna3、pcdna4、pcdna5、pcdna6、pcmv、pef1、pegfp、pet、peasy、pac5、pacgp、pacycduet、pbluescript、pbudce、pcambia、pcold、pcr2、pcr3、pcr4、pdsred、pgem、pgl、pires、ppic、pmal或pvrcsv1.0等中的一种或多种。

20、另一方面，本发明提供一种重组病毒，其基因组包含根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统。

21、根据本发明的一些实施方式，所述病毒选自痘苗病毒、腺病毒、i型单纯疱疹病毒(hsv-1)、ii型单纯疱疹病毒(hsv-2)、水疱性口炎病毒、埃可病毒、呼肠孤病毒、甲病毒、黄热病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、寨卡病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、m1病毒、马尔堡病毒、慢病毒或逆转录病毒中的一种或多种。

22、再一方面，本发明提供一种用于治疗乏氧性疾病的药物组合物，其包含根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统和用于治疗乏氧性疾病的病毒、或者根据本发明的重组病毒，以及任选的药学上可接受的辅料。

23、根据本发明的一些实施方式，所述治疗乏氧性疾病的病毒选自痘苗病毒、腺病毒、i型单纯疱疹病毒(hsv-1)、ii型单纯疱疹病毒(hsv-2)、水疱性口炎病毒、埃可病毒、呼肠孤病毒、甲病毒、黄热病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、寨卡病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、m1病毒、马尔堡病毒、慢病毒或逆转录病毒中的一种或多种。

24、根据本发明的一些实施方式，所述药学上可接受的辅料选自磷酸钠、磷酸氢二钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物、氯化钠、山梨糖醇、肌醇、质量比为0.001％的泊洛沙姆188水溶液、质量比为0.005％的泊洛沙姆188水溶液、三羟甲基氨基甲烷(tris)、氯化镁或注射用水中的一种或多种。

25、根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物还包括其他治疗乏氧性疾病的药物活性成分，例如pd-1免疫检查点抑制剂和/或ctla-4免疫检查点抑制剂。

26、另一方面，本发明提供根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统、根据本发明的重组病毒或根据本发明的药物组合物在制备治疗乏氧性疾病的药物中的用途。

27、根据本发明的一些实施方式，所述乏氧性疾病为癌症。优选地，所述癌症为白血病和/或淋巴瘤。优选地，所述癌症为实体瘤，例如神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、肝癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌或脑癌中的一种或多种。

28、根据本发明的一些实施方式，所述药物为溶瘤病毒药物。

29、根据本发明的一些实施方式，所述药物为注射剂。

30、相应地，本发明提供一种治疗乏氧性疾病的方法，其包括向有需要的对象给予治疗有效量的根据本发明的响应缺氧环境控制目的基因表达的系统和用于治疗乏氧性疾病的病毒、根据本发明的重组病毒或根据本发明的药物组合物。

31、根据本发明的一些实施方式，所述乏氧性疾病为癌症。优选地，所述癌症为白血病和/或淋巴瘤。优选地，所述癌症为实体瘤，例如神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、胃肠道间质瘤(gist)、肝癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、肉瘤、甲状腺癌或脑癌中的一种或多种。

32、根据本发明的一些实施方式，所述给予采用瘤内注射和/或静脉给药方式。

33、本发明提供一种能够使病毒在缺氧条件下高效表达外源基因，且表达优于常氧条件的分子元件组合及其制备方法与应用。包含感应缺氧环境的人工转录因子的调控系统可应用在实体瘤等缺氧性疾病的治疗，特别是用于实体瘤治疗的溶瘤病毒。包含感应缺氧的人工转录因子的调控系统由缺氧反应元件、缺氧敏感人工转录因子、人工转录因子识别元件和目的基因表达框组成，该系统具有以下三大优势：1)感应缺氧的人工转录因子可在常氧环境下诱导高效表达，而在缺氧环境下表达抑制，保证了该系统的缺氧敏感性；2)缺氧环境下诱导人工转录因子低水平表达，解除对目的基因的抑制，从而启动目的基因高效转录和表达，从而实现缺氧环境的靶向递送，避免系统性给药引起的严重毒副作用；3)目的基因编码的蛋白并未作任何的缺氧敏感功能域修饰，可以确保目的基因编码的蛋白功能不受干扰，发挥出其最大的活性。

34、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅限制，在此不再一一赘述。