一种动物天然突变位点的筛选方法以及天然突变动物模型的筛选方法

本发明属于生物，具体涉及一种动物天然突变位点的筛选方法以及天然突变动物模型的筛选方法。

背景技术：

1、脑疾病是世界范围的主要公共健康问题之一。阿尔兹海默氏病、帕金森氏病和孤独症谱系障碍是发生率较高的脑疾病，且目前尚无治疗的有效手段。同时，这三种脑疾病都受到遗传因素的影响，已报道很多与疾病发生相关的易感基因，如与ad发病相关的app、abca7和psen等，与pd发病相关的pink1、lrrk2和gba等，以及与asd发病相关的wac、adnp和ankrd11等。另外，传统的模式动物，如线虫、果蝇、斑马鱼和啮齿类动物的大脑与人类大脑差异巨大，用这些动物建立的脑疾病模型存在非常大的局限性。相比之下，非人灵长类无论在遗传还是大脑结构和功能上都与人类相近，是建立脑疾病模型的理想动物。非人灵长类的大脑是最接近人类大脑的，非人灵长类动物模型的应用，让研究人员对大脑功能和脑疾病发展的分子机制有了更深刻的了解。尽管非人灵长类模型对科学研究尤其是神经科学领域的研究非常重要，但非人灵长类模型的应用目前面临着一些挑战，比如巨额费用，技术要求高。这从不同物种动物模型在研究中应用的数量上就能看出来，猴子和小鼠占总实验动物的比例分别是0.1％和80％。尽管这样，因为非人灵长类是与人类最相近的物种，在解剖结构、生理特征，免疫系统行为和认知功能都与人类高度相似，因此非人灵长类在生物医学领域的发展中仍扮演着不可替代的地位。人类疾病的研究一般都遵循相似的策略，即先于非生物个体如细胞中进行相关实验，如果实验得到成功，就开始在啮齿类动物模型上进行实验，然后再利用非人灵长类动物模型，最后才能到临床的测试。由于非人灵长类实验模型的匮乏，现在很多治疗手段都是在小鼠上试验过后，而直接在患者上进行效果监测，这也是很多新药尤其是神经疾病的新药在临床实验上失败的原因。

2、目前，主要有三种非人灵长类脑疾病模型：诱导损伤模型、基因工程模型和自然发生模型。诱导损伤型模型建模快，但很难完全模拟疾病的发生机制；基因工程模型可以较好地模拟疾病发生的遗传机制并验证基因功能，是脑疾病研究中一个非常重要的工具。但是基因操作非人灵长类模型的成功率很低、周期很长且成本很高。遗传和变异都是自然界的普遍现象，是繁衍和进化的基础。nature(2017)的一篇论著发现，任何子代都存在平均70.3个新发突变；子代新发突变与父母年龄成正相关，父亲每增加1岁，孩子增加1.51个新发突变；母亲每增加1岁，孩子增加0.37个新发突变。如果新发突变改变蛋白质的结构或者功能，可能导致子代患有单基因病。同样在猴群中，理论上只要群体足够庞大，也会存在携带新发突变的动物个体。因此自然发生的非人灵长类疾病模型对疾病的研究非常有价值，它排除了基因编辑可能脱靶的影响。但是用传统的一代测序很难在猴群中大规模筛选自然发生的疾病动物，采用二代高通量测序可以实现这一需求，然而目前市面上的二代测序产品都是针对人类的全外显子测序，非人灵长类的全外显子测序价格是人类全外显子测序的2倍。

3、近年来，随着慢病毒感染、zinc finger nuclease、talen等转基因技术的出现，尤其是crispr/cas9基因编辑技术的快速发展和在改造多种高低等动物基因组中的成功应用，使得构建基因突变的神经疾病非人灵长类动物模型并利用其进行疾病机理和干预策略研究变为可能。但是基因操作非人灵长类模型的成功率很低、周期很长且成本很高。

4、虽然crispr/cas9基因编辑技术的快速发展和在改造多种高低等动物基因组中的成功应用，使得构建基因突变的神经疾病非人灵长类动物模型并利用其进行疾病机理和干预策略研究变为可能。但是基因编辑方法制备疾病动物模型需要较多的雌猴作为卵子的供给，同时也需要相当数量的雌猴作为移植受孕的受体。近年来抗体靶向药的兴起，消耗了大量的实验用非人灵长类动物。自2020年以来实验用非人灵长类动物的价格从原来的1万/只飙升至20万/只，这大大增加了基因编辑方法制备疾病动物模型的费用负担。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种动物天然突变位点的筛选方法以及天然突变动物模型的筛选方法。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明首先提供食蟹猴的新发突变位点，其含有如下基因突变位点中的一种或以上：

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7、本发明还提供一种动物天然突变位点的筛选方法，包括如下步骤：

8、(1)设计并合成分子倒置探针：根据目标基因外显子序列设计并合成分子倒置探针，所述分子倒置探针覆盖目标基因的外显子区，所述分子倒置探针自5’端到3’端顺次为基因组同源序列1、正向pcr引物序列、反向pcr引物序列、基因组同源序列2；

9、(2)mips建库和磷酸化：将步骤(1)合成的分子倒置探针集中，形成mips库，mips库中各个分子倒置探针的捕获效率近似，然后对所述mips库的探针进行磷酸化处理；

10、(3)捕获目标序列，构建捕获文库：将步骤(2)中磷酸化处理后的mips库、dna聚合酶、dna连接酶、dntp加入到基因组dna中，进行捕获反应，捕获完成后，向捕获反应产物中加入外切酶和内切酶进行酶切反应，酶切反应完成后，以酶切反应产物为模板，以步骤(1)中所述正向pcr引物序列和所述反向pcr引物序列的互补序列为引物，同时在反向引物中加入编码序列进行pcr扩增，pcr扩增完成后，将不同编码序列的样本混到一起，得到捕获文库；

11、(4)捕获文库的高通量测序：步骤(3)捕获文库进行高通量测序；

12、(5)天然突变位点的筛选：分析得到的测序数据，找出所有频率小于0.01的突变位点，将得到的数据转换成人的基因组位置，并对突变位点进行功能注释，对注释后的突变进行sanger验证，验证为阳性的个体，验证其父母亲和/或同胞在该位点的基因型，确定其遗传状态是否为新发突变，遗传状态为新发突变的突变位点即为动物天然突变位点。

13、进一步地，步骤(1)中，所述基因组同源序列1和所述基因组同源序列2的长度均为20bp；

14、所述正向pcr引物序列自5’端到3’端为cttcagcttcccgat，所述反向pcr引物序列自5’端到3’端为atccgacggtagtgt。

15、进一步地，步骤(2)中，所述mips库的探针进行磷酸化处理的操作为：每25μl 100μm的探针用1μl t4磷酸化酶，于37℃条件下反应45分钟。

16、进一步地，步骤(3)中，所述捕获反应体积为25μl，基因组dna用量为100ng，分子倒置探针和dna拷贝数的比例为800:1；

17、所述捕获反应的程序为：60℃孵育22小时。

18、进一步地，步骤(3)中，所述酶切反应的体系为：所述25μl捕获反应产物中分别加入0.5μl exoi，0.5μl exoiii酶和0.8μl去离子水，ampligase buffer 10x 0.2μl；

19、所述酶切反应的反应条件为37℃45min→96℃2min。

20、进一步地，步骤(3)中，所述pcr扩增的反应程序为：98℃30秒，98℃10秒，60℃30秒，72℃30秒，72℃5分钟，其中第二到第四步30个循环。

21、进一步地，所述动物为食蟹猴。

22、本发明进一步提供一种天然突变动物模型的筛选方法，包括步骤：采用动物天然突变位点的筛选方法筛选动物天然突变位点，对于确定的新发突变，继续追踪观察其发育及行为表型，如发现带有突变的动物表现出刻板行为，学习记忆障碍，则认定其是天然突变动物模型。

23、本发明的有益效果：

24、本发明利用人类基因组外显子捕获的原理和方法，开发了适用于非人灵长类外显子靶向测序的技术，减少疾病动物模型制备的费用和缩短试验周期。

25、本发明与现有的制备动物模型的基因编辑方法相比其优点在于可以降低成本和缩短试验周期，得到更能模拟人类疾病发病机制的动物模型。

26、本发明筛选到现有技术中未发现的食蟹猴的新发突变位点。