人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学，具体是一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系及其制备方法。

背景技术：

1、青光眼是由于眼内压力升高而造成的一种不可逆的致盲眼病，人小梁网细胞作为一种重要的细胞类型，在青光眼的病因学研究和临床治疗中具有广泛的应用价值。在功能上，人小梁网细胞内有特定的神经递质和神经肽受体，包括肾上腺素、乙酰胆碱和神经肽y等，在眼内压调节中起着关键作用；同时，人小梁网细胞还能够合成不同类型的细胞外基质蛋白以及金属蛋白酶；另外，人小梁网细胞中的血管活性多肽和生长因子能够触发细胞内信号传导机制，这对于研究眼内压调节机制以及青光眼等眼病的发病机理具有重要意义。

2、然而，由于人小梁网细胞的来源有限且体外培养难度大，使得该类型细胞的研究和应用受到一定的限制。现有的小梁网细胞分离培养方法主要有两类：酶消化法和机械法；其中，酶消化法一般为使用酶、螯合剂(如edta)等切断细胞间的连接，使组织分散为单细胞悬液样品，但该方法存在消化时间过长的缺点，且会对细胞活性产生一定负面影响；机械法一般包括剪碎法、网搓法或研磨法，即使用剪刀、铜网或组织研磨器将组织剪碎，但上述方法存在培养周期长、贴壁率低和细胞得率较低等问题。现有的两种分离培养方法均满足不了临床对于小梁网细胞质量和数量的需求。

3、因此，开发一种高效、稳定且可重复的人小梁网细胞的体外扩增培养体系成为当前的研究重点。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系及其制备方法，可以实现人原代小梁网细胞的高效、稳定和可重复的体外扩增。

2、本发明技术方案如下：

3、一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系，包括组织消化液、完全培养基和特定细胞培养容器；其中：

4、所述组织消化液包括胶原酶a、人血白蛋白；

5、所述完全培养基包括胎牛血清、l-谷氨酰胺、肝素、内皮细胞生长补充剂、m199培养基；

6、所述特定细胞培养容器中包括a型明胶溶液。

7、优选的，所述组织消化液中胶原酶a的浓度为2～10mg/ml，人血白蛋白的浓度为2～10mg/ml。

8、优选的，所述完全培养基中胎牛血清的浓度为5～20％(v/v)，l-谷氨酰胺的浓度为1～5mg/ml，肝素的浓度为50～100μg/ml，内皮细胞生长补充剂的浓度为10～50μg/ml。

9、优选的，所述特定细胞培养容器中a型明胶溶液的浓度为0.1～1％(v/v)。

10、进一步优选的，所述特定细胞培养容器的制备方法为：将a型明胶溶液用0.22μm过滤器过滤，过滤完成后覆盖于培养皿底部，20～40℃静置放置0.5～3h进行包被后，用于人原代小梁网细胞的制备。

11、一种人原代小梁网细胞的制备方法，利用上述体外高效扩增培养体系进行制备，包括如下步骤：

12、(1)消化：将人小梁网组织放入3～10倍体积的组织消化液中，100～500rpm、20～40℃条件下消化0.5～3h，得细胞组织悬液；

13、(2)收集：向步骤(1)的细胞组织悬液中加入10～20倍体积的完全培养基，得重悬液1；将重悬液1于100～300g条件下离心3～10min，离心2～3次后弃上清，得细胞组织沉淀；拍散细胞组织沉淀，将细胞组织沉淀用1～5倍体积的完全培养基重悬，得重悬液2；

14、(3)接种：将步骤(2)的重悬液2接种至特定细胞培养容器中，在20～40℃、二氧化碳浓度为2～10％的条件下静置培养，使得细胞从组织中顺利爬出；当细胞达到一定密度时，进行细胞传代，以保持细胞的活力和增殖能力，直至获得所需数量的细胞。

15、优选的，步骤(1)中所述人小梁网组织的制备方法包括如下步骤：

16、①样本组织清洗：将样本组织放入细胞培养皿中，然后加入dpbs缓冲溶液清洗，以去除样本组织表面的污渍和粘液；

17、②小梁网分离：将清洗完成后的样本组织转移至新的细胞培养皿中，利用眼科镊和角膜剪将眼球后节、晶状体、虹膜等弃去，保留角膜环；寻找到透明角膜和突起的睫状肌，两者之间的网状具有色素的组织即小梁网组织，用眼科镊将其镊起，然后环形撕取得到整个小梁网组织。

18、本发明所提供的上述“酶解后包被”培养方式，先通过采用适当的酶缩短消化时间，提高人原代小梁网细胞的活性；然后在培养过程中采用特定细胞培养容器，容器中附有对组织块和细胞友好亲和的包被膜，能够促进细胞的贴壁和融合，大大缩短了培养周期，提高了扩增效率，且细胞活率可达99.6％以上。

19、有益效果：

20、(1)本发明提供了一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系，采用“酶解后包被”的培养方式，实现了人原代小梁网细胞的高效、稳定和可重复的体外扩增，与传统的培养方法相比，本发明的培养体系大大缩短了培养周期，提高了扩增效率，且细胞活率可达99.6％以上。

21、(2)本发明的制备方法简单易行，可操作性强，适用于大规模细胞扩增和工业生产。

技术特征：

1.一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系，其特征在于，包括组织消化液、完全培养基和特定细胞培养容器；其中：

2.如权利要求1所述的扩增培养体系，其特征在于，所述组织消化液中胶原酶a的浓度为2～10mg/ml，人血白蛋白的浓度为2～10mg/ml。

3.如权利要求1所述的扩增培养体系，其特征在于，所述完全培养基中胎牛血清的浓度为5～20％(v/v)，l-谷氨酰胺的浓度为1～5mg/ml，肝素的浓度为50～100μg/ml，内皮细胞生长补充剂的浓度为10～50μg/ml。

4.如权利要求1所述的扩增培养体系，其特征在于，所述特定细胞培养容器中a型明胶溶液的浓度为0.1～1％(v/v)。

5.如权利要求1所述的扩增培养体系，其特征在于，所述特定细胞培养容器的制备方法为：将a型明胶溶液覆盖于培养皿底部，20～40℃静置放置0.5～3h。

6.一种人原代小梁网细胞的制备方法，其特征在于，利用权利要求1所述体外高效扩增培养体系进行制备，包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述人小梁网组织的制备方法包括如下步骤：

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述消化的条件为：在100～500rpm、20～40℃条件下消化0.5～3h。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的条件为：在100～300g条件下离心3～10min，离心2～3次。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述静置培养的条件为：在20～40℃、二氧化碳浓度为2～10％的条件下静置培养。

技术总结本发明提供了一种人原代小梁网细胞的体外高效扩增培养体系及其制备方法，属于生物医学技术领域，该体外扩增培养体系包括组织消化液、完全培养基和特定细胞培养容器；其中：所述组织消化液包括胶原酶A、人血白蛋白；所述完全培养基包括胎牛血清、L‑谷氨酰胺、肝素、内皮细胞生长补充剂、M199培养基；所述特定细胞培养容器中包括A型明胶溶液。本发明可以实现人原代小梁网细胞的高效、稳定和可重复的体外扩增，相比于传统的培养方法，具有更高的扩增效率，且细胞活率可达99.6％以上。技术研发人员：张菲凡,苑志欣,刘佳,曹启龙,朱玮,曹俊宁受保护的技术使用者：青岛海尔生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18