一种Ru-NiB纳米酶的制备方法及其应用与流程

本发明涉及纳米材料和创面修复的再生医学，具体地说是一种通过杀灭伤口处细菌、消耗葡萄糖并产生氧气来治疗糖尿病溃疡的纳米酶制备方法。

背景技术：

1、糖尿病的发病率逐年增加，已成为威胁人类健康的主要疾病之一，而最常见的糖尿病综合征是糖尿病足溃疡(dfu)。dfu患者的5年死亡率为50％，截肢后上升到80％。dfu的主要特征是创面愈合极其缓慢，创面区域的高血糖、低氧和细菌感染加剧了dfu治疗的难度。一般来说，过多的葡萄糖氧化会增加氧气的消耗从而加重创面微环境的缺氧，皮肤相关细胞(成纤维细胞，血管细胞等)的功能会受到抑制，创面微血管的生成受到限制后将进一步导致氧气与营养物质的供应不足，从而阻碍创面的修复。更糟糕的是，细菌可以在不愈合的创面定植，分泌多糖、蛋白质和核酸形成细胞外聚合物并组成细菌生物膜，细菌生物膜引起的抗生素耐药性，抑制了抗生素的杀菌作用，加重了细菌感染，进一步危及糖尿病溃疡患者。大多数研究者致力于通过降糖、持续供氧、抗菌等方式促进糖尿病创面愈合。然而，这些不利因素并不是独立存在的，单一的治疗方式达成的效果是不尽如人意的，因此,从多角度入手的协同治疗策略及微环境的调控对糖尿病创面的愈合至关重要。

2、纳米酶是一类具有酶样活性的纳米材料，在医学生物学领域受到广泛关注。特别值得关注的是贵金属纳米酶，它们表现出显著的多酶活性。比如钌(ru)，因为它的过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)活性在抗菌方面得到了广泛应用。纳米酶抗菌是基于其pod活性：催化过氧化氢(h2o2)成有毒的羟基自由基(·oh)，进而破坏细菌结构，实现抗菌效果。然而，过氧化氢酶活性可以分解h2o2生成氧气(o2)，用于葡萄糖氧化。由于大多数纳米酶的酶活性还是过低，·oh的生成受到了严重的限制。为了得到高活性的纳米酶往往需要负载高剂量的贵金属，这将难以平衡剂量与生物安全性之间的关系。

3、论文chemical engineering journal 2023，466，143292(doi:10.1016/j.cej.2023.143292)所报道的修饰了葡萄糖氧化酶(gox)的金铂双金属纳米团簇酶(au/ptncs@gox)用于级联催化，通过gox有效消耗葡萄糖产生h2o2，而au/pt同时模拟过氧化物酶将h2o2转化为具有高度细胞毒性的·oh，从而达到满意的抗菌和抗生物膜效果。然而，葡萄糖氧化过程中所需的o2被忽略，底物不足会明显阻碍级联催化反应的进行。除此之外，这项技术对gox进行了装载，这就不得不考虑gox的用量和装载及释放的复杂工艺。

技术实现思路

1、本发明的目的为针对当前技术中存在的不足，提供一种ru-nib纳米酶的制备方法及其应用。该方法采用rucl3为贵金属底物，利用ru元素的多个价态和电子构型来实现所制得纳米酶的高催化活性；即通过将nabh4水溶液加入nicl2和rucl3的混合溶液中来还原ru3+，并通过nabh4的滴入速度调控ru团簇的大小，将超细ru团簇沉积在更易于制备的非晶态nib合金的表面，从而一步简单合成法得到了所需的ru-nib纳米酶。本发明制备工艺简单，生产周期短，原料价廉易得，节约了生产成本，适于大规模生产；得到的材料中的超细ru团簇表现出优异的类过氧化物酶(pod)和类过氧化氢酶(cat)活性。

2、本发明的技术方案是：

3、一种ru-nib纳米酶的制备方法，该方法包括以下步骤：

4、第一步，合成非晶态纳米酶

5、将nicl2·6h2o和rucl3在室温下溶于超纯水中，再在2～3min内滴入nabh4水溶液；反应在室温下保持3～8h静置，形成黑色沉淀，即粗制的非晶态纳米酶；

6、其中，每28ml～32ml超纯水加入126～130mg nicl2·6h2o、14～18mg rucl3、0.2-0.3ml0.5～1.5m hcl溶液；8ml～12ml nabh4水溶液；nabh4水溶液的浓度为0.8-1.2m；

7、第二步，精制非晶态纳米酶

8、用超纯水水冲洗4～6次上述黑色沉淀，将清洗后的沉淀进行冷冻干燥6～10h，得到洁净的ru-nib，即用于治疗糖尿病溃疡ru-nib纳米酶。

9、其中，所述的超纯水电阻率为17.5-18.2mω·cm；

10、该纳米酶包括非晶态nib合金和超细ru团簇，ru团簇以0.40～0.45nm的超细尺寸负载在非晶nib合金的表面上；平均直径为30nm的纳米颗粒相互连接而成的三维连续网状。

11、所述的方法得到的ru-nib纳米酶的应用，用于在治疗糖尿病溃疡的药物中和葡萄糖氧化酶联合使用，作为供氧剂和杀菌剂。

12、在糖尿病溃疡中，首先ru-nib纳米酶可以利用gox与葡萄糖的反应产物h2o2产生o2促进葡萄糖氧化的级联反应，补充创面微环境的氧供；其次，ru-nib纳米酶与h2o2反应产生毒性·oh，杀灭创面处的细菌，实现高效抗菌效果。

13、上述一种用于治疗糖尿病溃疡ru-nib纳米酶的制备方法，所用的原材料和设备均通过公知的途径获得，所用的操作工艺是本技术领域的技术人员所能掌握的。

14、本发明得到的非晶纳米酶具有类芬顿反应性能，生成的强氧化性活性氧物种能快速将许多有机化合物氧化，从而应用到废水降解处理上。

15、本发明的实质性特点为：

16、首先，当前技术中制得的ru金属无论是以单个粒子的形式还是负载在载体上，尺寸通常在2-20nm之间，而本发明制备的ru-nib纳米酶的ru是以0.42nm的超细尺寸负载在非晶nib合金上；二是超细ru团簇和非晶内核具有多重类酶样活性，可有效响应糖尿病创面微环境高效驱动级联催化反应，提高创面修复的效果；三是所制备的纳米酶通过形成超细贵金属团簇，保证了高催化活性，同时最大程度降低贵金属用量。

17、制备方法中，本发明的实质性特点一是采用一步还原法，直接合成了ru-nib纳米酶，避免了不必要的原料损耗，生产周期短、产量大；二是不同于以往选用乙二醇或者二甲基甲酰胺或二甲基亚砜等有机溶剂，本发明采用超纯水为溶剂，溶剂无毒性且储量丰富，简单易得，成本低廉；三是整个操作过程不会挥发出有毒有害的化学试剂(例如三氯甲烷)，安全系数高。

18、本发明的有益效果是：

19、本发明采用一步合成法制备了超细ru团簇负载在非晶态nib合金上的纳米酶，适于通过在糖尿病溃疡处原位触发级联催化反应，实现补充氧供和抗菌高效协同创面修复效果。具体体现在：

20、(1)本发明一种ru-nib纳米酶的制备方法及其应用，超细ru团簇均匀分布在非晶态nib合金表面，提供了高密度的活性位点。超细ru团簇表现出优异的类过氧化物酶(pod)和类过氧化氢酶(cat)活性，即1μg/ml ru-nib纳米酶呈现出的pod性能是1μg/ml非晶nib合金的26倍；同样的，50μg/ml ru-nib纳米酶呈现出的cat性能是50μg/ml非晶nib合金的4.8倍。

21、(2)本发明一种ru-nib纳米酶的制备方法及其应用，超细ru团簇是高效级联催化剂，即在糖尿病溃疡中，加入gox，能在o2存在下可以催化创面处的高血糖氧化生成葡萄糖酸和h2o2；生成的h2o2继续被超细ru团簇通过pod和cat活性高效催化生成·oh和o2，起到高效的抗菌效果和缓解创面的缺氧微环境，从而实现多策略联合修复创面，有效避免了gox的毒副作用，可实现高效抗菌治疗，为开发新型高效创面修复联合治疗策略提供新思路；

22、(3)本发明一种ru-nib纳米酶的制备方法及其应用，采用一步合成法，制备工艺简单，生产周期短，原料价廉易得，节约了生产成本，适于大规模生产；

23、(4)本发明一种ru-nib纳米酶的制备方法及其应用，生产过程中不使用剧毒原料或者易挥发的化学试剂，生产过程安全环保。

24、(5)本发明在治疗手段上采取感染创面原位添加gox以避免装载和释放的难题并且精准掌控用量，避免天然酶的过度消耗。比如在现有的cn114470177a技术中每10mg原材料中就要添加100μl，1mg/ml的gox，而我们每治疗一只小鼠仅需要10μl，0.5mg/ml的gox，节省了20倍的gox用量。