一种荧光微球的制备方法、应用与流程

本发明属于功能化荧光微球领域，具体涉及一种荧光微球的制备方法、应用。

背景技术：

1、荧光微球一般指微球的表面标有荧光物质(包括表面包覆)或微球体内结构含有荧光物质(如包埋或聚合)的微球，受到外界能量刺激能激发出荧光。它是一种载有荧光分子的功能性微球，其外形可以为任意形状，一般为球形。近年来,随着荧光探针技术研究的深入，人们已经能够制备各种各样的粒径从纳米级到亚微米级的荧光微球。荧光微球有比较稳定的形态结构及发光行为，受溶剂、热、电、磁等外界条件的影响比纯荧光化合物小很多。荧光微球的载体多为有机或无机聚合物材料，根据载体及荧光物质的不同，将荧光微球分为三大类：(1)无机/有机荧光微球；(2)无机/无机荧光微球；(3)有机/有机荧光微球。无机/有机荧光微球又分为无机材料为载体，荧光物质为有机化合物和有机材料为载体,荧光物质为无机化合物两大类。另外，根据荧光物质在载体微球中所处的位置不同，可将荧光微球分为两大类：(1)荧光物质处于载体微球表面的荧光微球；(2)荧光物质处于载体微球内部的荧光微球。

2、荧光微球的制备方法主要有物理吸附法、自组装法、包埋法、化学键合法、共聚法。但在目前荧光微球的制备方法中，所制备得到的荧光微球往往只能应用于单中平台的荧光检测，如包埋稀土荧光配合物的微球主要应用于荧光发光平台的检测，因为稀土荧光配合物本身就具有荧光性质。再如表面修饰有化学发光底物的微球，往往是应用于化学发光平台的检测。而目前比较少有荧光微球应用于两个或多个发光平台的检测。可能是因为同时包覆或者修饰两种性质不同的荧光物质或者发光底物会影响荧光微球自身的发光强度、机械稳定性、光稳定性、热稳定性等等。多个发光平台的检测会使得荧光微球的应用范围扩大，可以根据现有的实验平台，灵活地调控具体的检测方式，减少检测成本。

3、另外，在目前的荧光微球制备方法中，荧光微球中的荧光物质易脱落，负载或修饰生荧光物质后可能荧光微球性质会不稳定等等。

4、有鉴于此，提供一种可以应用于两个或多个发光平台、荧光物质不易脱落、光稳定性高的荧光微球制备方法，对于目前荧光微球的应用有着重要的实际意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题与不足，本发明提供一种荧光微球的制备方法、应用。利用本发明所提供的制备方法所得到的荧光微球，单分散好，且负载或修饰的荧光物质不易脱落，荧光强度高、光稳定性高，可以同时用于荧光和化学发光两个平台检测。

2、根据本发明的第一个方面，提供一种荧光微球的制备方法，包括如下步骤：s1.制备聚合物微球：利用可聚合单体、乳化剂制备聚合物微球；可聚合单体包括单体a、单体b、单体c，且单体a、单体b、单体c的用料比为0.0351g～0.12g：0.2ml～1.2ml：2ml～13ml；单体a包括苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺中的至少一种；单体b为二烯基单体；单体c包括丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯胺、对苯乙烯磺酸的至少一种；s2.制备荧光微球：s2.1先将荧光染料包埋于聚合物微球内部，得到含荧光染料微球；荧光染料的用量为，1.5～1.7μl固含量为14～16％的聚合物微球溶液中，加入1.5～1.7μl浓度为1.8～2.2mm的荧光染料溶液；s2.2再进一步将化学发光底物接枝于含荧光染料微球表面，得到荧光微球；化学发光底物的用量为，190～210μl固含量为14～16％的含荧光染料微球溶液中，加入9～11μl浓度为0.45～0.55ng/ml的化学发光底物溶液。

3、首先，本发明通过利用上述三种单体所制备得到的聚合物微球，其机械稳定性强，更有利于包埋更多的荧光染料，且在包埋过程中，即使聚合物微球被溶胀也不会明显降低其荧光强度。具体而言，单体a类物质玻璃化转变温度较高，刚性较强，有利于形成较为规整的高分子链，赋予聚合物微球较强的机械强度。单体b类物质为交联剂，一定量的单体b有利于聚合物形成更为紧密的三维网络结构，进一步增强聚合物微球的机械强度。单体c具有一定的官能基团，能够给聚合物微球提供一定的活性基团，有利于聚合物微球与荧光染料以及化学发光底物结合，使荧光物质不易脱落。且上述几种单体在特定的比例范围内，还能够使聚合物微球具有一定的柔韧性，使得聚合物微球有适合的溶胀空间，有利于兼顾聚合物微球中荧光染料的包封以及化学发光底物的表面修饰。若超过上述比例，不仅聚合物微球的机械稳定性会有所降低，还会降低荧光染料的包封以及化学发光底物的修饰，进而影响荧光微球的荧光强度以及光稳定性。

4、另外，对于荧光染料以及化学发光底物与聚合物微球的用量比例也需要控制在一定范围内，因为在进行荧光染料包封或者化学发光底物修饰的时候，会使用溶剂现将荧光染料以及化学发光底物先溶解后引入，过多的溶剂可能会造成对聚合物微球稳定性有所影响，且荧光染料或化学发光底物过多可能也不利于荧光微球的稳定性，而且，如果荧光染料过多，也不利于后续化学发光底物在聚合物微球表面的修饰。而荧光染料或化学发光底物过少，则会造成荧光微球荧光强度会有所减弱。即，仅有保证荧光染料以及化学发光底物的用量在特定的范围内，才能兼顾这两者的包封或者修饰，使荧光微球在荧光以及化学发光平台的检测中皆有较好的荧光强度，能够实现较低检测限，使荧光微球在双平台检测中皆具有较高的灵敏度；同时不影响荧光微球的机械稳定性等，使荧光物质不容易失效、氧化，提高荧光微球有较好的光稳定性。

5、优选地，制备聚合物微球的具体步骤如下：s1.1.将乳化剂、水、单体a、单体b混合乳化，排清溶液中的空气后，向其中加入引发剂，在68～73℃下反应25～35min；s1.2接着将部分单体c加入到步骤s1.1所得到的体系中，保温反应1.8h～2.2h后，再向其中加入剩余部分单体c，继续保温反应5.5～6.5h，得到聚合物微球。经过上述步骤制备得到的聚合物微球，粒径均一，且分散性好，且具有较好的机械稳定性、热稳定性等，其表面富含羧基或者氨基等活性基团，能够对荧光物质进行有效地包封，同时表面可以被化学发光底物良好地修饰。而因为上述方法合成的聚合物微球兼具刚性和柔性，内部结构稳定，能够将荧光物质有效地截留在微球内部。同时因为聚合物微球表面富含羧基或者氨基等活性基团，化学发光底物也能够牢固地接枝在其表面而不容易脱落。

6、优选地，乳化剂包括聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠及聚乙烯醇的至少一种。

7、优选地，在上述制备聚合物微球的s1.1中，还需加入聚乙二醇。聚乙二醇为一种微球溶胀剂，可以使得微球有一定的溶胀，促进荧光物质进入微球。

8、优选地，聚乙二醇的分子量为3500～4000。

9、优选地，乳化剂、引发剂、聚乙二醇的用料比为0.1g～0.38g：0.15g～0.52g：0.8g～1.1g；且单体a与乳化剂的用量比为0.0351g～0.12g：0.1g～0.38g。

10、优选地，引发剂包括过硫酸钾。

11、优选地，在s1中，单体a为苯乙烯，单体b为二乙烯基苯，单体c为丙烯酸。当使用这几种单体时，所得到的聚合物微球能够更好地平衡刚性、柔性，此时聚合物微球的综合性能更好，更有利于荧光染料在微球内部的截留和化学发光底物在微球表面的修饰，促进荧光强度的增强。同时这几种单体制备的聚合物微球对荧光微球的荧光强度影响最小，能够进一步提高荧光微球的光稳定性。

12、优选地，在s1.1中，荧光染料包括稀土荧光配合物、荧光素、量子点中的至少一种。

13、优选地，荧光染料为稀土荧光配合物；稀土荧光配合物包括ln(m)3n、ln(m)3n2中的至少一种；其中，ln为稀土元素的至少一种，m为苯甲酰三氟丙酮、2-噻吩甲酰三氟丙酮中至少一种，n为8-羟基喹啉、邻菲啰啉的至少一种。稀土配合物荧光寿命长、发射带窄且尖锐、stokes位移大，检测时受背景及杂散光干扰较少。且稀土配合物对聚合物微球本身的机械性能影响较低，同时更容易被截留在聚合物微球内部。

14、优选地，稀土元素包括la、ce、lu、tb、yb、sm、nd中的至少一种。

15、优选地，制备荧光配合物的步骤如下：步骤一，将m单体、n配体溶解于第一醇类溶剂，接着将所得到的溶液的ph调节至6.0～7.0；步骤二，将含ln的稀土盐溶解于第二醇类溶剂，得到稀土元素盐溶液，向步骤一所得到的体系中加入稀土元素盐溶液，常温反应5.5～6h，过滤、洗涤、干燥，得到稀土荧光配合物；在上述步骤一、步骤二中，m单体、n配体、ln稀土元素的摩尔比为0.95～1.05:2.95～3.05:0.95～1.05。

16、优选地，第一醇类溶剂、第二醇类溶剂独立地包括乙醇。

17、优选地，在s2.1中，化学发光底物包括碱性磷酸酶、吖啶酯、辣根过氧化物酶中的至少一种。

18、优选地，化学发光底物为吖啶酯。吖啶酯含有-nhs基团，能够与聚合物微球表面的羧基反应，可以牢固的锚定在聚合物微球表面。

19、优选地，s2.1的具体操作为：将荧光染料溶液与聚合物微球溶液混合，并加入溶胀剂，于107～112℃中反应8～12min，洗涤、干燥，即得。

20、优选地，溶胀剂包括二氯甲烷、己烷、环己烷、乙二醇中的至少一种。

21、优选地，s2.2的具体操作为：向含荧光染料微球溶液中加入催化剂活化后，继续加入化学发光底物溶液反应，洗涤、干燥，即得。

22、优选地，当化学发光底物吖啶酯，s2.2的具体操作为：向含荧光染料微球溶液中加入edc、nhs，荧光染料微球、edc、nhs的质量比为48～52:0.95～1.05:0.95～1.05，常温活化反应28～32min后，继续加入化学发光底物溶液，室温反应1.8～2.2h，洗涤、干燥，即得。

23、优选地，荧光微球的直径为70～250nm。若荧光微球的粒径较小，则荧光微球的机械稳定性会差，造成荧光微球的光稳定性差。若荧光微球的粒径较大，聚合物微球对内部包封的荧光染料的荧光强度会造成一定的劣化，降低荧光微球的荧光强度。

24、根据本发明的第二个方面，提供一种利用上述荧光微球的制备方法制备得到的荧光微球在检测aβ1-40蛋白中的应用。

25、根据本发明的第三个方面，提供一种用于检测aβ1-40蛋白的试剂盒，包括荧光微球，荧光微球通过利用上述荧光微球的制备方法制备得到。