一种近红外荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于侧流免疫层析，具体涉及一种近红外荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、在即时检验(poct)平台上，准确、灵敏、快速地检测复杂样本中的靶标对疾病的诊断、监测和流行病学研究至关重要。其中侧流免疫层析(lfia)因其便携、简易、快速、成本低廉等优点而被广泛应用。传统的lfia通常使用金纳米粒子、荧光染料、量子点等可见光区域(400-700nm)的荧光材料作为信号探针。然而，复杂样本固有的颜色导致的强吸收以及样本产生的高自发荧光显著降低了传统lfia检测的准确性和灵敏度。此外，复杂样本难以通过离心来纯化检测靶标，以及硝化纤维素(nc)膜的光散射也会干扰检测结果。

2、目前，传统的解决方式是稀释生物样本，但这会进一步降低检测准确性和灵敏度，且不能完全消除背景噪音，从而限制了lfia在复杂样本检测中的应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种近红外荧光探针及其制备方法和应用，达到完全消除复杂样品中的强吸收和高自发荧光以及nc膜的光散射等背景干扰，其荧光量子产率提高至14.76％，无需任何样本预处理步骤，可直接检测复杂样品中的靶标，提高在复杂样本中的检测准确性和灵敏度的目的。

2、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

3、针对传统lfia在复杂样本检测中遇到的挑战，近红外(nir)荧光材料(700-1700nm)的出现提供了一种可能的解决途径。nir荧光材料能够减少光吸收和光散射，降低样本自发荧光的影响，从而提高检测的灵敏度和准确性。不同类型的近红外纳米材料能够应用于lfia，例如有机染料分子(如聚集诱导发光(aie)分子)和无机纳米材料(如量子点和上转换纳米粒子)。其中，经研究发现基于nir-aie分子的荧光纳米粒子因其良好的光稳定性、stokes位移大、以及易于被生物配体修饰等优点。

4、本发明目的在于提供一种近红外荧光探针，包括近红外聚集诱导发光纳米粒子ps@aie830np，近红外聚集诱导发光纳米粒子为近红外聚集诱导发光分子溶液aie830封装到聚苯乙烯纳米粒子中制得。

5、研究发现，目前大多数nir-aie荧光纳米粒子的量子产率(qy)还相对较低(<10％)，这导致其检测灵敏度低，限制了其定量检测靶标的能力和应用范围。本发明设计了一种主要由聚苯乙烯(ps)纳米粒子和近红外聚集诱导发光分子(aie830)组成的近红外聚集诱导发光纳米粒子作为荧光探针，可完全消除复杂样品中的强吸收和高自发荧光以及nc膜的光散射等背景干扰，其荧光量子产率提高至14.76％。结合nir-lfia便携式定量仪器，无需任何样本预处理步骤，可直接检测复杂样品中的靶标(酱油中的黄曲霉毒素(afb1)、关节液中的金黄色葡萄球菌生溶血素(hla)、溶血样本中的c反应蛋白(crp))，提高在复杂样本中的检测准确性和灵敏度。

6、进一步的，近红外聚集诱导发光分子aie830的分子式为

7、

8、一种近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

9、s1：近红外聚集诱导发光纳米粒子ps@aie830np的合成制备：将聚苯乙烯纳米粒子水溶液与表面活性剂搅拌混合，然后将aie830溶液加入有机溶剂中充分混合，再加入前述聚苯乙烯纳米粒子混合物中，经过搅拌、透析、离心，得最终产物备用；

10、s2：采用s1制备的纳米粒子ps@aie830np制备ps@aie830np-ab纳米标记探针：将ps@aie830np离心后重悬，冰浴超声，然后加入sulfo-nhs溶液和edc溶液，搅拌混合离心后重悬冰浴超声，添加目标抗体搅拌形成ps@aie830np-ab，用bsa溶液封闭，将混合物离心重悬冰浴超声后，得到ps@aie830np-ab纳米标记探针。

11、进一步的，s1中聚苯乙烯纳米粒子水溶液浓度为10-500mg/ml，表面活性剂浓度为1-20mg/ml，aie830溶液浓度为1-50mg/ml。

12、进一步的，有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、苯甲醇、乙二醇、甲苯、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺或丙酮中的一种或几种。

13、进一步的，表面活性剂为乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚、曲拉通x-405、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种。

14、一种近红外荧光探针在检测复杂样本中靶标的应用，复杂样本中靶标包括酱油样本中afb1、关节液样本中hla和溶血样本中crp。

15、一种近红外荧光探针在检测酱油afb1样本中的应用，检测方法为用pbs缓冲液将已知浓度的含afb1的酱油样品稀释为不同浓度，分别为1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml、0ng/ml，取30μl不同浓度的酱油样品稀释液，与1μl的ps@aie830np-ab/afb1探针和70μl的bbs缓冲液充分混合，将混合液加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，使用近红外检测仪器测量t线和c线的荧光强度，并将数据处理计算出t/c线荧光强度比值，建立t/c线的荧光强度比值与afb1/hla浓度的相关标准曲线；

16、取30μl待测酱油样品和1μl的ps@aie830np-ab/afb1探针加入70μl的bbs缓冲液，充分混合后加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，观察t线和c线是否出现荧光带判断样品是否含有afb1，同时对t/c线的荧光强度比值与前述的标准曲线进行对比定量样品中目标检测物的浓度。

17、一种近红外荧光探针在检测关节液hla样本中的应用，检测方法为用pbs缓冲液将已知浓度的含hla的关节液样品稀释为不同浓度，分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.1μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.19μg/ml、0.08μg/ml、0.04μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0μg/ml，取30μl不同浓度关节液样品稀释液，与0.5μl的ps@aie830np-ab/hla探针、0.5μl的ps@aie830np-ab/lgy探针和70μl的bbs缓冲液充分混合，将混合液加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，用近红外检测仪器测量t线和c线的荧光强度，并将数据处理计算出t/c线荧光强度比值，建立t/c线的荧光强度比值与afb1/hla浓度的相关标准曲线；

18、取30μl关节液hla样品、0.5μl ps@aie830np-ab/hla探针和0.5μl ps@aie830np-ab/lgy探针加入70μl bbs缓冲液，充分混合后加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，观察t线和c线是否出现荧光带判断样品是否含有hla，同时对t/c线的荧光强度比值与前述的标准曲线进行对比定量样品中目标检测物的浓度。

19、一种近红外荧光探针在检测溶血样本中的应用，检测方法为用pbs缓冲液将已知浓度的溶血样品稀释为不同浓度分别为80mg/l、70mg/l、60mg/l、50mg/l、40mg/l、20mg/l、10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、1.25mg/l、0.62mg/l、0.31mg/l、0.156mg/l、0.08mg/l、0.04mg/l、0mg/l，取1μl不同浓度的溶血样品稀释液，与1μl的ps@aie830np-ab/crp探针和60μl的bbs缓冲液充分混合，将混合液加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，用近红外检测仪器测量t线和c线的荧光强度，并将数据处理计算出t/c线荧光强度比值，建立t/c线的荧光强度比值与crp浓度的相关标准曲线；

20、取1μl的溶血样品、1μl的ps@aie830np-ab/crp探针加入70μl的bbs缓冲液，充分混合后加入到免疫层析试纸条的加样孔处，反应完成后，观察t线和c线是否出现荧光带判断样品是否含有crp，同时对t/c线的荧光强度比值与前述的标准曲线进行对比定量样品中目标检测物的浓度。

21、进一步的，检测复杂样本中靶标所用到的免疫层析试纸条的制备方法为：用捕获抗体或者抗原在硝酸纤维素膜上划出检测线，用所检测抗体的二抗在硝酸纤维素膜上划出质控线，在硝酸纤维素膜的两端设置样品垫和吸水垫得到免疫层析试纸条，样品垫上含有与检测抗体偶联的近红外聚集诱导发光纳米粒子，捕获抗体/抗原可与目标分析物特异性结合，质控线喷涂的二抗可与检测抗体特异性结合。

22、与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

23、1、本发明主要采用聚苯乙烯(ps)纳米粒子和近红外聚集诱导发光分子(aie830)组成的近红外聚集诱导发光纳米粒子作为荧光探针，可完全消除复杂样品中的强吸收和高自发荧光以及nc膜的光散射等背景干扰，其荧光量子产率提高至14.76％。

24、2、本发明的近红外荧光探针可用于检测复杂样品中的靶标，如酱油中的黄曲霉毒素(afb1)、关节液中的金黄色葡萄球菌生溶血素(hla)、溶血样本中的c反应蛋白(crp)，提高在复杂样本中的检测准确性和灵敏度。

25、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述内容和其目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。