一种基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球及其制备方法与应用

本发明属于体外诊断，尤其涉及一种基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球及其制备方法与应用。

背景技术：

1、近年内人类基因组和蛋白质组的发展和完成，引起对大规模分析生物分子的巨大需求，推动以编码微球为核心的液相悬浮生物芯片快速发展。快速高通量的流式细胞术和磁性分离作为分析手段的液相悬浮生物芯片，对蛋白、核酸和小分子等标志物进行快速高通量的多重检测，逐渐成为精确诊断的新目标。其中发展高编码容量和稳定性的编码微球依然是巨大的挑战，合适的编码微球设计具有如下要求：光稳定性高、抗磁性好、编码数量多、无重吸收和串扰效应等。

2、光谱信号由于编码灵活、解码速度快等被广泛地应用液相生物芯片的构建，目前，常用的光谱编码材料主要是有机材料、量子点、上转换点和光子晶体等等。量子点由于高亮度、窄的发射光谱成为流行的编码材料，但是量子点的编码能力受限于量子点荧光信号之间的重吸收和串色效应，限制量子点编码微球的应用。

3、目前，商业化液相生物芯片luminex系统和bd公司的cytometric珠阵列等均使用有机染料进行编码，但是传统有机材料在聚集状态下出现荧光猝灭现象，限制传统有机材料的编码容量和稳定性。2001年唐本忠院士团队发现的新型的聚集诱导发光(aie)材料，是制备编码微球有前景的编码材料，因为aie材料可以在聚集过程实现荧光信号的原位增强。聚集诱导发光材料具有大斯托克斯位移、强的耐光漂白性、抗磁性等性质，是一种优异的编码微球材料。但是，鲜有见到使用aie材料高效地制备磁性荧光编码的公开报道。因此，开发一种粒径均一、荧光均一性强且编码能力强的聚集诱导发光磁性编码微球是十分必要的。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种基于原位聚合包覆的聚集诱导发光(aie)磁性编码微球及其制备方法与应用，所述聚集诱导发光磁性编码微球具有斯托克斯位移大、荧光强度高和编码容量高等特点。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球，包括aie聚合物微球及磁性颗粒；

4、所述aie聚合物微球为aie分子通过原位聚合包覆法包埋在空白聚合物微球内部得到，所述原位聚合包覆法中aie分子用量为空白聚合物微球用量的0.01-10wt％；

5、所述磁性颗粒通过铁盐的原位沉淀法沉积于aie聚合物微球表面，所述原位沉淀法中铁盐用量为空白聚合物微球用量的3-30wt％。

6、优选地，所述空白聚合物微球选自聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球和聚丙烯酸缩水甘油酯微球中的至少一种；

7、进一步优选地，所述空白聚合物微球选自聚苯乙烯微球或者聚丙烯酸缩水甘油酯微球。

8、优选地，所述磁性颗粒为fe3o4；

9、优选地，所述铁盐选自三价铁盐和二价铁盐中的至少一种；进一步优选地，所述三价铁盐选自三氯化铁·六水合物和无水三氯化铁中的至少一种；所述二价铁盐选自氯化亚铁·四水合物、氯化亚铁·二水合物、硫酸亚铁和硫酸亚铁·七水合物中的至少一种；

10、进一步优选地，考虑到aie聚合物微球表面沉积磁性颗粒的均一性，所述铁盐为三价铁盐和二价铁盐的复配，三价铁盐质量用量为二价铁盐质量用量的10％～60％。

11、优选地，所述aie分子选自下列aie-1分子至aie-16分子中的至少一种：

12、

13、

14、aie-1分子中的烷基链-c8h17各自独立的为支链烷基或直链烷基。

15、aie-11分子中的烷基链-c6h13各自独立的为支链烷基或直链烷基。

16、优选地，所述原位聚合包覆法为将aie分子、反应性单体、引发剂和交联剂与空白聚合物微球在反应体系的分散相中发生溶胀聚合反应使aie分子包埋在空白聚合物微球内部；

17、进一步优选地，所述原位聚合包覆法中，所述反应性单体选自苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸异氰基乙酯中的至少一种，所述引发剂选自偶氮二异丁腈(aibn)、过氧化二苯甲酰、偶氮二异戊腈、过氧化氢异丙苯和偶氮二异庚腈中的至少一种，所述交联剂选自二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二异氰酸酯和n,n-亚甲基双丙烯酰胺中的至少一种；所述空白聚合物微球的粒径范围为0.03μm～50μm。

18、更优选地，所述空白聚合物微球的的粒径范围为0.5μm-20μm。所述引发剂选自偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰。所述交联剂选自二乙烯苯或二甲基丙烯酸乙二醇酯。

19、进一步优选地，所述原位聚合包覆法中，所述aie分子的质量用量为反应性单体质量用量的0.001％～10％，所述引发剂的质量用量为反应性单体质量用量的0.1％～10％，所述交联剂的质量用量为反应性单体质量用量的1％～50％。

20、优选地，所述原位沉淀法为加入碱性溶液与aie聚合物微球表面螯合的铁盐原位反应生成磁性颗粒沉积于aie聚合物微球表面。

21、进一步优选地，所述原位沉淀法中，所述aie聚合物微球的表面经磺化改性，所述碱性溶液选自氢氧化钠溶液、氨水、氢氧化钾溶液和碳酸氢钠溶液中的至少一种；

22、优选地，所述基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球的流式荧光信号的cv值及流式fcs的cv值均小于10％，编码峰≥10重。

23、上述的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球的制备方法，包括如下步骤：

24、s1.原位聚合包覆法制备aie聚合物微球

25、将空白聚合物微球分散在水中，加入溶胀剂溶胀微球，得到微球分散液；

26、将aie分子、引发剂和交联剂溶解于反应性单体中，加入微球分散液，溶胀反应后，再加入稳定剂，加热去除溶胀剂，离心去上清，得到aie聚合物微球；

27、s2.原位沉淀法制备基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球

28、将步骤s1的aie聚合物微球溶于硫酸溶液中，升高温度反应后，离心去上清，得到表面经磺化改性的aie聚合物微球，将其与铁盐和水混合反应，离心去上清，得到铁盐螯合的aie聚合物微球，加入碱性溶液，升高温度，铁盐原位反应生成磁性颗粒沉积于aie聚合物微球表面，离心去上清，制备得到基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球。

29、优选地，所述的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球的制备方法包括以下步骤：

30、s1.原位聚合包覆法制备aie聚合物微球

31、将空白聚合物微球分散在水中，加入溶胀剂溶胀微球0.1～6h，得到微球分散液；

32、将aie分子、引发剂和交联剂溶解于反应性单体中，加入微球分散液，溶胀反应0.5～6h后，再加入稳定剂，升高温度至60℃～100℃反应2～12h去除溶胀剂，离心去上清，得到aie聚合物微球；

33、s2.原位沉淀法制备基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球

34、将步骤s1的aie聚合物微球溶于硫酸溶液中，升高温度至30℃～100℃反应4～12h后，离心去上清，得到表面经磺化改性的aie聚合物微球，将其与铁盐和水混合，浸泡反应0.5～10h后，离心去上清，得到铁盐螯合的aie聚合物微球，加入碱性溶液，升高温度至40℃～120℃反应0.5h～4h，铁盐原位反应生成磁性颗粒沉积于aie聚合物微球表面，离心去上清，制备得到基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球。

35、进一步优选地，步骤s1中，去除溶胀剂的时间为2h～10h。更优选地，所述去除溶胀剂的时间为4h，温度为80℃。

36、进一步优选地，步骤s2中，所述浸泡反应的时间为2～4h；加入碱性溶液后反应的温度为60℃～80℃。

37、优选地，步骤s1中，所述微球分散液的空白聚合物微球质量用量为水质量用量的0.1％～20％，溶胀剂的质量用量为水质量用量的0.05％～40％；所述溶胀剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、苯甲醚、苯甲醇和甲苯中的至少一种；

38、进一步优选地，所述微球分散液的空白聚合物微球质量用量为水质量用量的0.5％～10％。所述溶胀剂选自二氯甲烷、四氢呋喃或甲苯。

39、优选地，步骤s1中，所述的稳定剂的质量用量为水质量用量的0.01％～5％；所述的稳定剂选自聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇中的至少一种；

40、优选地，步骤s2中，所述硫酸溶液的质量浓度为70％～99％；所述aie聚合物微球的质量用量为硫酸溶液质量用量的1％～30％；

41、进一步优选地，所述硫酸溶液的质量浓度为98.3％；所述aie聚合物微球的质量用量为硫酸溶液质量用量的5％～20％。

42、优选地，步骤s2中，所述铁盐的质量用量为水质量用量的0.0005％～25％；所述的碱性溶液质量用量为水质量用量的0.1％～50％；所述碱性溶液的质量浓度为1％～10％；

43、优选地，步骤s1、步骤s2中所述的水为超纯水；所述的离心的转速为3000rpm～6000rpm，离心的时间为5min～60min，所述离心的次数为三次以上。

44、进一步优选地，所述的离心的转速为4000rpm～6000rpm，离心的时间为5min～20min，所述离心的次数为三次。

45、上述的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球在体外非疾病诊断检测中的应用。

46、本发明提出一种原位聚合包埋技术和原位生成高效制备聚集诱导发光(aie)磁性编码微球的新技术，将aie分子通过原位聚合包埋进微球基质内部，并利用铁盐的原位生成法在微球表面生成磁性颗粒，同时通过调控aie分子及铁盐用量，得到粒径均一且荧光均一性强的单波长高编码容量的聚集诱导发光磁性编码微球，具有优异的检测稳定性，可实现10重及以上编码。

47、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

48、(1)本发明的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球与传统磁性编码微球的荧光材料相比，aie材料提高磁性编码微球的编码容量，解决传统荧光材料在磁性基质下易猝灭的现象，即使在高磁含量微球中，单波长aie编码容量也能达到10重容量。

49、(2)本发明通过简便地原位聚合包埋和原位生成技术，将数以亿计的aie分子包覆在微球内部，磁性颗粒原位沉积在微球表面，通过调控aie分子和铁盐的用量，得到最佳性能的aie磁性荧光编码微球。

50、(3)本发明的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球具有典型的聚集诱导发光性质，aie分子嵌入在微球内部中，在聚集体中能够发出强烈的荧光，同时aie材料本身强的耐光性提供优异地检测稳定性。

51、(4)本发明的基于原位聚合包覆的聚集诱导发光磁性编码微球制备方法简便，实现了aie分子在制备编码微球中的有效应用，为编码元素增加一种重要的荧光材料，为蛋白质生物芯片核心原材料提供一种新的策略。