一种基于双功能BSA-MnO2QDs构建比率荧光传感器检测酸性磷酸酶的方法

本发明属于分析检测领域，涉及一种基于双功能bsa-mno2 qds构建比率荧光传感器检测酸性磷酸酶的方法，更具体地，涉及一种基于高氧化物酶活性bsa-mno2 qds的高灵敏比率荧光传感器检测酸性磷酸酶的方法。

背景技术：

1、荧光分析具有灵敏度高、操作简单、信号响应快速等优点，是目前最常用的检测方法之一。然而，大量荧光方法采用单波长输出模式，容易受到微环境和激发源波动的干扰，导致系统误差大、结果不准确、重现性低。为了解决这些缺点，比率荧光法应运而生。比率荧光法利用双波长信号输出的比值，可以有效地消除外界环境的干扰，所得结果仅与被分析物本身有关，因此该方法更准确。基于不同的模式和机制，比率荧光方法包括荧光共振能量转移(fret)、内滤效应(ife)、光致电子转移(pet)等。根据不同的模式和机理，可以分别构建单信号波动和双信号波动比率荧光方法；与前者相比，后者具有更低的背景信号。同时，它的双信号反向变化，可以获得更高的灵敏度。比率荧光法还需要引入不同的荧光材料，包括量子点、纳米团簇、碳点、荧光染料和上转换荧光材料。其中，量子点在比例荧光法的发展中起着不可或缺的作用。

2、量子点或半导体纳米晶体主要由ⅱ族过渡元素和ⅵ族元素组成，在过去的几十年里已经成为传感、成像和光学器件的重要组成部分。量子点具有宽的激发波长范围和窄的发射波长范围。因此，通过调节激发波长，可以最大限度地减少生物样品的自发荧光，提高分辨率和灵敏度。量子点具有较强的抗光漂白能力和较高的光化学稳定性，约为普通荧光染料的100倍。此外，量子点的荧光寿命更长，可达数十纳秒，比典型有机荧光染料的几纳秒长得多。这样，经过几纳秒的光激发，大部分自发荧光背景已经衰减，但量子点的荧光仍然存在，可以得到没有背景干扰的荧光信号。此外，单独的量子点具有良好的水溶性、低毒性和良好的生物相容性。由于这些独特的光学性质，量子点可以代替有机荧光染料作为理想的荧光探针。

3、纳米酶是一种与天然酶类似的具有催化活性的纳米材料。纳米酶具有稳定性高、制备简单、性价比高、易于储存等优点，已逐渐成为天然酶的替代品。纳米酶具有高活性、易修饰等特点，在生物传感、环境保护、抗菌、抗肿瘤和细胞保护等领域有着广泛的应用。自从发现fe3o4纳米颗粒具有内在的过氧化物酶活性以来，人们一直在努力探索具有类似天然酶活性的纳米材料。到目前为止，已经发现了大量具有酶活性的纳米材料，包括金属氧化物、贵金属和碳基纳米材料。然而，大多数纳米材料只提供单一的酶活性。随着科学技术的发展，研究人员开始关注多功能纳米酶的研究。例如，二氧化锰纳米片被发现同时具有内在氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性。将铂纳米粒修饰在fe3o4纳米粒表面，使其同时具有磁性和过氧化物酶性质。通过对羰基进行表面修饰，可以得到具有超高过氧化物酶活性的碳纳米管量子点。与单一的酶活性纳米材料相比，多功能纳米酶结合了自身的特性和酶活性，是未来实时诊断领域的新型生物传感探针。

4、酸性磷酸酶(acp)是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。它主要存在于前列腺、肝和脾体、细胞和骨骼中。当这些器官发生病变，如前列腺癌伴骨转移、原发性或转移性骨肿瘤、白血病、乳腺癌、肝炎、肝硬化、溶血性疾病等，血清acp高表达。因此，acp可以作为辅助诊断和预后指标的必要生物标志物，对其进行分析是必要的。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，合成了一种新的具有荧光性质的纳米酶bsa-mno2 qds，利用bsa-mno2 qds建立了比率荧光传感系统，并将基于高氧化酶活性bsa-mno2 qds的灵敏荧光传感器检测acp，该方法能够简单快速、直观的、高灵敏的检测acp。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种双功能bsa-mno2 qds，它是以四水合氯化锰(mncl2·4h2o)为原料、以双氧水为氧化剂合成mno2纳米片，再以mno2(mno2)纳米片为前驱体、以bsa为刻蚀剂，采用水热法，制备得到的bsa-mno2量子点(bsa-mno2 qds)。

4、具体的，所述的双功能bsa-mno2 qds是由以下方法制得的：

5、步骤(a)、将0.1～1g mncl2·4h2o溶解在10～30ml超纯水中得到氯化锰溶液；在剧烈搅拌下，往氯化锰溶液中加入1～5ml质量分数为30％的双氧水，室温反应10～15h，反应液离心，沉淀依次用乙醇和超纯水清洗，真空干燥，研磨，得到mno2纳米片；

6、步骤(b)、将10～40mgmno2纳米片加入到20ml浓度为0.25～3mg/ml的bsa水溶液中，超声溶解，120℃反应8～10h，离心，弃去沉淀，上清液采用截留分子量为3500da的透析袋透析去除杂质，真空干燥，得到bsa-mno2量子点。

7、步骤(a)中，优选的，将0.4gmncl2·4h2o溶解在20ml超纯水中。

8、优选的，每0.4gmncl2·4h2o使用2ml质量分数为30％的双氧水。

9、优选的，反应的时间为12h。

10、所述的离心的转速为12000rpm，离心的时间为3～10min，优选为5min；

11、步骤(b)中，优选的，将20mg mno2纳米片加入到20ml浓度为1mg/ml的bsa水溶液中。

12、所述的离心的转速为转速12000rpm，离心的时间为10-30min，优选为20min。

13、一种基于双功能bsa-mno2 qds构建比率荧光传感器检测酸性磷酸酶的方法，包括如下步骤：

14、步骤(a)、合成mno2纳米片：以四水合氯化锰(mncl2·4h2o)为原料、以双氧水为氧化剂合成mno2纳米片；

15、步骤(b)、合成双功能纳米复合材料bsa-mno2 qds：以mno2纳米片为前驱体、以bsa为刻蚀剂，采用水热法制备bsa-mno2量子点(bsa-mno2 qds)；

16、步骤(c)、构建酸性磷酸酶比率荧光传感器：往醋酸-醋酸钠缓冲液中加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠(aap)溶液和不同浓度的酸性磷酸酶溶液，在温度30～40℃下孵育10～40min，再加入含邻苯二胺(opd)和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液，在温度30～40℃下孵育1～10分钟，得到检测体系；在380nm激发光下测量检测体系的荧光发射曲线，获得438nm和570nm处荧光强度的荧光比值f1/f2；以acp的浓度为横坐标、荧光比值f1/f2为纵坐标，建立acp标准曲线；

17、步骤(d)、样品检测：按照步骤(c)测得未知酸性磷酸酶浓度的待测样品的荧光比值f1/f2，代入步骤(c)的acp标准曲线，得到待测样品中酸性磷酸酶浓度。

18、步骤(c)中，所述的2-磷酸-l-抗坏血酸三钠溶液是以超纯水或醋酸-醋酸钠缓冲液为溶剂配制的。

19、所述的酸性磷酸酶溶液是以超纯水或醋酸-醋酸钠缓冲液为溶剂配制的。

20、所述的醋酸-醋酸钠缓冲液为ph 3.0～5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，优选为ph 4.0醋酸-醋酸钠缓冲液。

21、优选的，往醋酸-醋酸钠缓冲液中加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠和酸性磷酸酶后，所述的孵育的温度为35℃，所述的孵育的时间为30min。

22、所述的含邻苯二胺和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液是将邻苯二胺溶液和bsa-mno2qds溶液加入到磷酸盐缓冲液中得到的。

23、所述的邻苯二胺溶液是以超纯水或磷酸盐缓冲液为溶剂配制的。

24、所述的bsa-mno2 qds是以超纯水或磷酸盐缓冲液为溶剂配制的。

25、所述的磷酸盐缓冲液为ph 6～8磷酸盐缓冲液，优选为ph 7.5磷酸盐缓冲液。

26、优选的，加入含邻苯二胺(opd)和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液后，所述的孵育的温度为35℃，所述的孵育的时间为5分钟。

27、所述的醋酸-醋酸钠缓冲液、2-磷酸-l-抗坏血酸三钠溶液、性磷酸酶溶液和含邻苯二胺和bsa-mno2 qds磷酸盐缓冲液的体积比为40:5:5:450。

28、所述的检测体系中，2-磷酸-l-抗坏血酸三钠的终浓度为5～15mm，优选为10mm；bsa-mno2 qds的终浓度为1～10μg/ml，优选为5μg/ml；opd的终浓度为1～5mm，优选为2mm；酸性磷酸酶的浓度为0.1～1.5mu/ml，具体可以选自0.1,0.25,0.5,1,1.5mu/ml。

29、具体的，构建酸性磷酸酶比率荧光传感器：将50μl opd溶液和50μl bsa-mno2 qds溶液加入到350μl磷酸盐缓冲液中得到含opd和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液；往40μl醋酸-醋酸钠缓冲液中加入5μl 2-磷酸-l-抗坏血酸三钠溶液和5μl不同浓度的酸性磷酸酶溶液，孵育，再加入450μl含opd和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液，孵育，得到检测体系。

30、步骤(d)中，具体的，样品检测：往醋酸-醋酸钠缓冲液中加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠溶液和未知酸性磷酸酶浓度的待测样品，在温度30～40℃下孵育10～40min，再加入含邻苯二胺和bsa-mno2 qds的磷酸盐缓冲液，在温度30～40℃下孵育1～10分钟，得到检测体系；在380nm激发光下测量检测体系的荧光发射曲线，获得438nm和570nm处荧光强度的荧光比值f1/f2，将荧光比值f1/f2代入步骤(c)的acp标准曲线，得到待测样品中酸性磷酸酶浓度。

31、所述的待测样品选自血清。

32、当所述的待测样品为血清时，将血清与10％三氯乙酸按体积1:1混合，冰浴冷却10分钟，离心，取上清。

33、本发明方法的检测机理(图1)：bsa-mno2 qds具有氧化酶的活性，并能催化游离o2形成超氧自由基(o2·-)。基于bsa-mno2 qds的类氧化酶活性，建立了定量测定acp的比率荧光传感器。在没有acp的情况下，bsa-mno2 qds的氧化酶样活性不能被aap抑制，因此将opd催化氧化成2,3-二氨基吩嗪(dap)，丰富的催化产物dap与bsa-mno2 qds量子点之间发生了ife，导致bsa-mno2 qds量子点在438nm处的荧光强度降低。相反，在acp存在的情况下，acp水解aap生成aa，从而抑制bsa-mno2 qds的氧化酶活性，导致dap产量下降。因此，ife也被抑制，bsa-mno2 qds在438nm处的荧光强度恢复。

34、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

35、1、本发明制备了一种新型的“二合一”多功能bsa-mno2量子点，bsa-mno2量子点具有优良的荧光特性和高的类氧化酶活性。

36、2、本发明基于bsa-mno2量子点构建了一种高灵敏度、高选择性的比率荧光传感器用于检测酸性磷酸酶，线性范围为0.1～1.5mu/ml，检测限为0.038mu/ml。

37、3、本发明构建的比率荧光传感器可以成功应用于人血清样本中酸性磷酸酶的测定。