一种四氧化三铁壳聚糖微球的制备方法及蛋白质的固定方法

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种四氧化三铁壳聚糖微球的制备方法及蛋白质的固定方法。

背景技术：

1、蛋白质(酶)的固定化技术是指利用物理或者化学的方法将水溶性的蛋白质固定在固相材料的一类技术，由此得到的固定化蛋白质仍能保持其生物学活性。蛋白质固定化技术的方法有很多，总的来说分为物理法和化学法两个大类，具体分为包埋法固定、吸附法固定、化学交联法固定和共价结合法固定等。

2、壳聚糖又称为可溶性几丁质、可溶性甲壳素或者脱酰甲壳素。壳聚糖是从虾、蟹等的外壳中提取的一种胺基多糖，来源丰富，具有生物相容、生物降解、无毒、抗菌、螯合重金属离子、对蛋白质有高度亲和等特点，是一种非常好的固定化载体。壳聚糖分子表面富含胺基和羟基，反应活性比较高，可通过功能化修饰或改性方法使壳聚糖在改善其溶解性的同时，被赋予各种不同的功能特性，将壳聚糖与磁性物质进行结合得到磁性壳聚糖，能够提高其稳定性及机械强度，使其容易分离从而广泛应用于各种领域。

3、四氧化三铁壳聚糖微球是一种新型功能高分子材料，它是内部含有磁性的四氧化三铁的超细粉末，从而形成具有磁响应的高分子微球。此微球可以通过化学方法在微球表面引入多种反应性功能的基团，也可以通过共价键结合蛋白、细胞和特异性抗体等活性物质，最主要的是可以通过外加磁场表现出强烈的磁响应性，从而快速分离。

4、如何提供一种简单高效、可控大小的四氧化三铁壳聚糖微球的制作方法是目前急需要解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种四氧化三铁壳聚糖微球的制备方法。本发明提供的制备方法简单高效，微球的大小可由壳聚糖乙酸的浓度进行控制，制备便捷，且其表面的胺基含量丰富，分布均匀。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、一种四氧化三铁壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：

4、1)将fe3o4与壳聚糖乙酸溶液混合，超声振荡处理，分散均匀；

5、2)将步骤1)所得混合液与液体石蜡、span-80常温搅拌混合均匀；

6、3)向步骤2)所得混合液中加入戊二醛，在35℃～45℃中搅拌均匀；

7、4)将步骤3)所得混合溶液调节ph值到9.0-10.0，升温至60℃～80℃搅拌反应；

8、5)将步骤4)所得混合液降温至室温，洗涤后，用磁铁收集，得到四氧化三铁壳聚糖微球。

9、本发明中，四氧化三铁壳聚糖微球即磁性微球是通过反相悬浮交联法制得的，使用30％～60％质量浓度的戊二醛，优选为50％浓度的戊二醛作为交联剂，把壳聚糖和四氧化三铁交联起来，壳聚糖均匀牢靠的把四氧化三铁粒子进行包裹，经过一段时间孵化后最后形成圆润微球。其中，可提前配置多种浓度的壳聚糖乙酸，使用不同浓度的壳聚糖乙酸进行制备，可得到不同大小尺寸的四氧化三铁壳聚糖微球。

10、进一步地，步骤1)中，所述超声的时间为15min～30min，超声强度为30～60kw；步骤2)中，搅拌时间为15min～20min，搅拌速度为200～400r/min；步骤3)中，搅拌时间为30～60min，搅拌速度为200～400r/min；步骤4)中，搅拌时间为100min～120min，搅拌速度为200～400r/min。

11、进一步地，步骤1)中，所述壳聚糖乙酸溶液的浓度为0.01g/ml～0.03g/ml，所述fe3o4与壳聚糖乙酸溶液的固液比为1g:100ml～300ml；优选为1g：150ml～250ml；

12、步骤5)中，所述洗涤具体为依次用石油醚、丙酮、酒精和蒸馏水进行洗涤。

13、进一步地，所述fe3o4与所述液体石蜡的固液比为1g：250ml～400ml；所述fe3o4与所述span-80的固液比为1g：10ml～20ml；所述fe3o4与所述戊二醛的固液比为1g：20～40ml。

14、进一步地，步骤4)中，用浓度为0.8～1.5mol/lnaoh调节混合溶液ph值到9.0-10.0，优选浓度为1mol/l。

15、本发明的目的之二在于提供上述任一制备方法制备得到的四氧化三铁壳聚糖微球，本发明制备得到的四氧化三铁壳聚糖微球，其表面的胺基含量丰富，分布均匀。

16、本发明的目的之三在于提供一种蛋白质的固定方法，包括以下步骤：

17、(1)融合蛋白的修饰

18、将带有acp标签的融合蛋白表面的巯基封闭，再引入游离巯基，盐析后得到修饰后的融合蛋白；

19、(2)磁性微球的修饰

20、将上述制备方法所得四氧化三铁壳聚糖微球与交联剂反应，得到修饰后的磁性微球；

21、(3)将修饰后的融合蛋白与修饰后的磁性微球混合，调节ph至6.5～7.5，进行反应固定，待固定完全后，收集微球，进行洗涤即可。

22、本发明提供的蛋白质的固定方法中，融合蛋白的获取方法包括：将构建的质粒pet28b-acp-gfp、pet28b-acp-mcherry和pet28b-acp-tev转化进bl21(de3)菌株中，挑单菌落摇种子液进行扩培，待od600到达0.6时添加诱导物iptg，在25℃表达24h。然后12000rpm离心取菌体进行破碎，最后经过纯化得到acp-gfp、acp-mcherry和acp-tev；即得到带有acp标签的融合蛋白：acp-gfp、acp-mcherry和acp-tev。

23、进一步地，步骤(1)中，巯基封闭具体为将纯化的带有acp标签的融合蛋白样品透析至巯基封闭缓冲液中，并加入终浓度8～12mm的3，4-二溴马来酰亚胺溶液，置于20～30℃恒温培养箱反应3～5h；其中，带有acp标签的融合蛋白样品为上述方法获取得到的acp-gfp、acp-mcherry和acp-tev中的一种或多种；优选的，加入终浓度10mm的3，4-二溴马来酰亚胺溶液，置于25℃恒温培养箱反应4h；其中，巯基封闭缓冲液为100mm ph8.0的pbs缓冲液。

24、进一步地，步骤(1)中，引入游离巯基具体为将巯基封闭后得到的样品透析至coa修饰缓冲液中，按照sfp与底物1:8～12的比例(优选1:10的比例)加入sfp酶，coa的终浓度为1-10mm，置于35～40℃恒温培养箱中反应3～5h；优选的，加入sfp酶和终浓度10mm的coa，置于37℃恒温培养箱中反应4h；其中，coa修饰缓冲液(coabuffer)：10mm mgcl2，50mmhepes，用hcl调ph至7.5。

25、进一步地，步骤(1)中，盐析具体为向引入游离巯基后的样品中加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵终浓度到达70～80％，冰浴3～5h，然后离心去除上清，用10mm pbs缓冲液溶解沉淀的蛋白；优选的，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵终浓度到达75％，冰浴4h，然后在10000～15000rpm转速低温(0～5℃)离心20min去除上清，用固定化缓冲液溶解沉淀的蛋白。

26、进一步地，步骤(2)具体包括：

27、将上述所得四氧化三铁壳聚糖微球至于80～120mm的ph为7～9的pbs缓冲液中充分溶胀，然后用磁铁将微球从溶液中收集起来，转移至8～12mm的sulfo-smcc的溶液中，调ph至7-8然后缓慢振荡反应完全，得到修饰后的磁性微球。优选的，pbs缓冲液的浓度为100mm，ph为7；sulfo-smcc的浓度为10mm；振荡反应时间为3～5h，优选为4h；其中，四氧化三铁壳聚糖微球与sulfo-smcc的固液比为2～6mg：1ml，优选为4mg：1ml。

28、进一步地，步骤(3)中，还包括加入3，4-二溴马来酰亚胺，即将3，4-二溴马来酰亚胺、修饰后的融合蛋白与修饰后的微球混合，调节ph至6.5～7.5，缓慢振荡3-5h，待固定完成后，用磁铁收集微球，用pbs充分清洗微球表面，然后浸泡在80～120mm pbs缓冲溶液中0～6℃保存即可；优选的，振荡时间为4h，浸泡在100mm pbs缓冲溶液中4℃保存。

29、本发明中，在磁性微球表明利用acp标签介导蛋白固定，主要分为两个步骤，一是acp-x(x表示gfp、mcherry或tev)蛋白的修饰，首先经过3，4-二溴马来酰亚胺将融合蛋白表面的巯基封闭，再利用sfp酶对acp进行磷酸泛酰巯基乙胺修饰，得到游离的巯基；二是磁性微球的修饰，利用磁性微球表面的大量胺基与交联剂sulfo-smcc反应，随之再与含有acp标签的巯基反应介导蛋白固定化。sulfo-smcc是一种可与巯基和胺基特异性反应的双功能交联剂，在分子的两端含有一个马来酰亚胺基团和一个n-羟基琥珀酰亚胺活性酯。马来酰亚胺基团可以与巯基共价反应，n-羟基琥珀酰亚胺活性酯与胺基特异结合。

30、本发明有益效果至少包括：

31、(1)微球以磁性的四氧化三铁为内核，可以依靠系统外部的磁力从反应体系中快速分离，方便快捷、简单高效。

32、(2)本发明使用了壳聚糖这种具有生物相容性聚合物，磁性微球的大小可由壳聚糖乙酸的浓度进行控制，制备便捷，且其表面的胺基含量丰富，分布均匀。

33、(3)交联剂充分利用了壳聚糖表面的胺基，价格低廉，反应活性高，在壳聚糖表面分布均匀，修饰反应操作便捷。

34、(4)本发明利用sulfo-smcc修饰后的壳聚糖与巯基特异性反应，建立了基于标签acp提供巯基的融合蛋白生产方法，固定化过程不依赖于目的蛋白，具有蛋白质固定的通用性，且可便于多种相关蛋白质(酶)的共固定。