使用编码颗粒的数字核酸扩增的制作方法

交叉引用本申请要求2017年11月3日提交的第62/581,429号美国临时申请的权益，出于所有目的将该申请的全部内容通过引用并入本文。背景数字测量可以在某些生物学测定中起重要作用，因为它们可以提高给定测定的灵敏度、准确性和稳定性。此外，模拟测量可能需要通过对校准标准品的额外分析来校准，而可以基于二进制值的列表的数字测量可以降低进行给定生物学测定的技术复杂性。可以使用诸如聚合酶链反应(pcr)的扩增方法来检测样品中的靶分子，如核酸(例如dna或rna分子)。在pcr的情况下，诸如dna分子的靶分子在由dna聚合酶催化的温度敏感反应中被扩增。在引物核酸分子和核苷三磷酸分子存在的情况下，通过使dna循环通过一系列温度，其通常范围为约60℃至约95℃，在每个温度下持续规定长度的时间，dna的拷贝数增加。pcr可用于大范围的科学领域，包括基础生物学、临床诊断、基因工程和法医学。概述本文描述了使用包含编码颗粒的分隔体积和探针进行数字测定的方法和系统。特别地，本发明描述了用于在包括多个分隔体积的系统中改善对目标分子的数字分析的方法、系统和装置。例如，本文描述的方法和系统可以用于测量在其中可以检测可检测信号或代码的分隔体积的体积和分隔体积的数量，所述体积和数量可以随后用于确定样品的浓度。本发明还描述了与传统测定(例如，模拟测定)相比，能够改善靶分子的分子水平探询的速度、动态范围和再现性，并增加可以在单一测定中分析的靶分子种类的量(例如，不同类型的靶分子的数量)的方法、系统和装置。特别地，与数字分析的常规方法和系统相比，本文所述的方法、系统和装置可以改善以其确定靶分子的存在、不存在、身份或浓度的速度、准确性和计算效率。这是通过与靶分子的存在相关的分隔体积中的靶分子的扩增实现的。此外，目标分子的扩增可以用于调节数字测定中可检测信号或代码的检测，从而提高数字测定的速度、准确性和可靠性。在各个方面，本文描述的方法包括进行数字测定的方法，所述方法包括多个分隔体积，其中所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含探针，其中每个探针包含编码颗粒和能够结合于靶分子或结合于与靶分子的存在相关的分子的结合区，并且其中所述编码颗粒具有至少一个大于3nm的尺寸，以及所述多个分隔体积中的至少一些分隔体积包含所述靶分子。本文还描述了用于扩增靶分子并检测由分隔体积中的编码颗粒发射的光学可检测代码的方法，其中检测到所述光学可检测代码表明所述靶分子存在于所述分隔体积中。在各个方面，本文所述的方法包括一种方法，所述方法包括：提供多个分隔体积，其中：在所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含探针，其中每个探针包含编码颗粒和能够结合于靶分子或结合于与靶分子的存在相关的分子的结合区，并且其中所述编码颗粒具有至少一个大于3nm的尺寸；和所述多个分隔体积中的至少一些分隔体积包含所述靶分子；扩增与靶分子的存在相关的分子；和检测由所述分隔体积中的编码颗粒发射的光学可检测代码，其中检测到所述光学可检测代码表明所述靶分子存在于所述分隔体积中。在各个方面，用于进行数字测定的方法和系统包括光学可检测代码，所述光学可检测代码包括以下至少一种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在其他方面，所述光学可检测代码包括以下至少两种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在其他方面，所述光学可检测代码包括以下至少三种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在一些方面，所述光学可检测代码包括以下至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在各个方面，所述光学可检测代码可以是选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的单一类型的光学可检测代码或选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的类型的光学可检测代码的组合。在本发明的各个方面，所述光学可检测代码具有至少2个发射峰、至少3个发射峰、至少4个发射峰、至少5个发射峰、至少6个发射峰、至少7个发射峰、至少8个发射峰、至少9个发射峰或至少10个发射峰。在本发明的各个方面，本文所述的方法和系统包括编码颗粒，所述编码颗粒的特征在于以下至少一种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在其他方面，所述编码颗粒的特征在于以下至少两种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在其他方面，所述编码颗粒的特征在于以下至少三种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在其他方面，所述编码颗粒的特征在于以下至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种：(i)发射峰波长；(ii)在给定波长下的发射峰强度；(iii)发射峰光谱强度；(iv)发射寿命；和(v)吸收峰波长。在各个方面，所述编码颗粒的特征在于选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的单一类型的性质或选自(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的类型的性质的组合。在其他方面，所述编码颗粒的特征在于至少2个发射峰、至少3个发射峰、至少4个发射峰、至少5个发射峰、至少6个发射峰、至少7个发射峰、至少8个发射峰、至少9个发射峰或至少10个发射峰。在各个方面，每个探针的光学可检测代码包括测量可检测代码的光谱强度。在一些方面，所述分隔体积包含至少一个编码颗粒，所述至少一个编码颗粒包含与所述多个分隔体积中存在的至少一个其它编码颗粒不同的光学可检测代码。在一些方面，所述分隔体积包含多个编码颗粒，其各自包含与所述多个分隔体积中存在的至少一个其它编码颗粒不同的光学可检测代码。在各个方面，可以基于所述光学可检测代码的光谱强度检测所述分隔体积中的所述靶分子的存在。在各个方面，检测的发射峰强度可以包括检测多个发射波长。在一些方面，在所述发射峰的最大峰处测量所述发射峰强度。在本发明的各个方面，所述可检测代码的光谱强度包括在不同发射波长范围处测量0.01至100、0.05至50、0.1至10、1至100、1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、0至10、0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1的发射峰强度的比率。在一些方面，所述光学可检测代码可以包括发光或荧光信号。在各个方面，所述多个分隔体积包含多个探针；每个分隔体积包含至少一个探针；所述多个探针中的第一独特探针包含与所述多个探针的第二独特探针的结合区不同的结合区；并且所述多个探针中的所述第一独特探针包含编码颗粒，所述编码颗粒能够发射与所述多个探针的所述第二独特探针的光学可检测代码不同的光学可检测代码。在一些方面，每个独特探针的所述光学可检测代码包括独特的一组：发射峰光谱强度、发射峰波长、吸收峰波长、激发峰波长、发射寿命或其组合。在一些方面，可以检测多个独特靶分子。在一些方面，所述多个分隔体积包含至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000个独特探针。在各个方面，编码颗粒可以包含基质。在一些方面，编码颗粒包含发色团。在一些方面，编码颗粒包含多个发色团。在一些方面，编码颗粒包含至少三个染料单元。在某些方面，编码颗粒包含聚合物点。在一些方面，所述编码颗粒的所述基质是发色团或多个发色团。在一些方面，所述编码颗粒的所述基质包含无机材料、有机材料或其组合。在一些方面，所述基质包含二氧化硅、硅酸盐、二氧化钛、磷酸盐、聚合物或其组合。在各个方面，所述基质包含半导体聚合物。在一些方面，所述基质包含聚苯乙烯(ps)或聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)。在各种情况下，所述发色团包含无机材料、有机材料或其组合。在一些方面，所述编码颗粒包含有机和无机材料的互穿网络。在各个方面，所述发色团包含染料、小分子染料、聚合物、金属络合物、半导体纳米晶体、半导体聚合物或其组合。在一些情况下，所述发色团是荧光或发光发色团。在各种情况下，所述编码颗粒具有至少一个3nm至1000nm、10nm至500nm、25nm至250nm、50nm至100nm、10nm至50nm、10nm至30nm、10nm至20nm、或5nm至15nm的尺寸。在各个方面，探针还包含猝灭剂，其中在不存在所述靶分子的情况下或在扩增所述靶分子之前，所述猝灭剂降低所述光学可检测代码的强度。在一些方面，使所述猝灭剂连接到所述探针的结合区。在一些方面，所述猝灭剂能够结合于所述探针的结合区。在一些方面，在所述扩增期间或之后，可以增加所述编码颗粒与所述猝灭剂之间的距离。在一些方面，可以通过切割所述猝灭剂与所述编码颗粒之间的连接来增加所述编码颗粒与所述猝灭剂之间的距离。在各个方面，所述扩增包括或伴随切割所述探针的结合区。在一些方面，所述扩增包括产生多个拷贝。在一些方面，所述扩增包括产生与所述靶分子的存在相关的分子的多个拷贝。在一些方面，扩增包括产生扩增产物。在一些方面，所述扩增包括或伴随切割所述探针的所述结合区。在各个方面，所述结合区包含被配置成杂交于所述靶分子或杂交于与所述靶分子的存在相关的分子的核酸。在一些方面，所述结合区的第一部分能够与所述结合区的第二部分杂交。在各个方面，所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含多个探针，其中至少一个探针包含：结合区，其被配置成结合于与所述分隔体积中的至少一个其它探针相同的独特靶分子或结合于与所述分隔体积中的至少一个其它探针相同的独特靶分子的存在相关的分子；和编码颗粒，其能够发射与所述分隔体积中的至少一个其它探针相同的光学可检测代码。在一些方面，所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含多个探针，其中每个探针包含：结合区，其被配置成结合于与所述分隔体积中的至少一个其它探针不同的独特靶分子或结合于与所述分隔体积中的至少一个其它探针不同的独特靶分子的存在相关的分子；和编码颗粒，其能够发射与所述分隔体积中的至少一个其它探针不同的光学可检测代码。在各个方面，本文所述的方法和系统包括延伸探针的第一结合区，其中延伸所述第一结合区使得探针杂交于相同探针的第二结合区。在一些方面，延伸所述结合区使得第一探针结合于第二探针的结合区，并且所述第一和第二探针能够产生相同的可检测的光学代码。在各个方面，本文所述的方法和系统包括通过酶的活性延伸结合区，其中所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含酶。在一些方面，通过酶的活性延伸的所述结合区能够结合于相同探针的结合区或结合于不同探针的结合区，其中结合于另一探针的每个探针能够产生与其所结合的探针相同的光学可检测代码。在一些方面，所述酶是聚合酶。在各个方面，本文所述的方法和系统包括在扩增期间或之后将所述多个探针的一个探针与所述多个探针的另一探针连接以形成探针网络，其中所述连接仅在靶分子的存在下或在与所述靶分子的存在相关的分子的存在下发生。在各个方面，每个探针包含多个不同的结合区。在一些方面，第一探针上的第一结合区与第二结合区之比为相同类型的第二探针上的第一结合区与第二结合区之比的1.0倍、1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在各个方面，所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含环化核酸，所述环化核酸包含能够结合于所述靶分子或结合于与所述靶分子的存在相关的分子的区域；和所述猝灭剂能够与所述环化核酸的扩增产物杂交。在一些方面，通过滚环扩增来扩增所述环化核酸。在各个方面，所述数字测定是数字核酸分析。在一些方面，所述数字核酸分析包括数字pcr。在各个方面，所述数字测定包括至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或至少45个温度循环。在一些方面，所述数字测定是等温测定。在一些方面，所述等温测定包括等温核酸扩增。在一些方面，所述分隔体积保持在40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃。在一些方面，所述分隔体积中的每个具有小于20pl、小于15pl、小于10pl、小于5pl、小于4pl、小于3pl、小于2pl或小于1pl的体积。在各个方面，本文所述的方法和系统包括数字测定系统，包括：多个分隔体积，其中所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含：扩增试剂；探针，其包含编码颗粒和能够结合于靶分子或结合于与所述靶分子的存在相关的分子的结合区，并且其中所述编码颗粒具有至少一个大于3nm的尺寸；和所述多个分隔体积中的至少一些分隔体积包含所述靶分子；检测器，其被配置成以光学方式检测由一个或多个分隔体积中的编码颗粒产生的光学可检测代码；和计算机，其包括处理器和在其上存储可执行指令的存储装置，所述指令在被执行时使处理器：运行所述检测器以测量所述光学可检测代码；存储所述测量的光学可检测代码；和分析所述测量的光学可检测代码。在一些方面，所述光学可检测代码包括发射波长、发射光谱、发射寿命、发射强度、发射强度范围、发射波长范围、吸收光谱、吸收波长范围、激发光谱和激发波长范围或其组合。在一些方面，所述光学可检测代码包括光谱强度。在一些方面，所述编码颗粒包含聚合物点。在各个方面，所述样品保持器能够在检测所述光学可检测代码期间保持所述多个分隔体积。在各个方面，本文描述的系统和方法还包括电磁辐射源。在一些方面，所述系统和方法还包括能够调节所述多个分隔体积中的至少一个分隔体积的温度的加热元件。在各个方面，本文所述的方法和系统包括进行数字解链曲线测定的方法，所述方法包括：提供分布到多个容器中的多个分隔体积，其中所述多个分隔体积中的至少一些分隔体积包含靶分子；将热能梯度施加到所述多个分隔体积以产生随区域变化的多个测定温度；和通过在温度梯度存在下进行所述靶分子或与所述靶分子的存在相关的分子的数字解链曲线测定，来确定所述靶分子或与所述靶分子的存在相关的分子的解链温度。在一些方面，将可变的热能施加到所述多个分隔体积以产生随时间变化的多个测定温度。在一些方面，所述多个容器包括多室自数字化芯片、多个小滴、多孔微流体芯片或多孔板。在各个方面，本文所述的方法和系统包括进行数字解链曲线测定的方法，所述方法包括：提供多个分隔体积，其中：所述多个分隔体积中的每个分隔体积包含能够杂交于靶分子或杂交于与靶分子的存在相关的分子的核酸；和所述多个分隔体积中的至少一些分隔体积包含所述靶分子；扩增所述靶分子以产生扩增的分子；将热能梯度施加到所述多个分隔体积以产生随区域变化的多个测定温度，使得当每个分隔体积中的测定温度：在靶分子或扩增的分子解链温度以下时，至少50％的所述靶分子或至少50％的所述扩增的分子杂交；和在所述靶分子或扩增的分子解链温度以上时，小于50％的所述靶分子或小于50％的所述扩增的分子杂交；检测由与所述杂交的靶分子或所述扩增的分子关联的发色团产生的光学可检测信号，其中当所述发色团与所述杂交的靶分子或所述扩增的分子关联时，检测所述光学可检测信号；和基于在所述多个测定温度中的每个测定温度下光学可检测信号的存在或不存在或幅度，确定所述靶分子或扩增的分子的解链温度。在一些方面，所述靶分子是核酸。在一些方面，施加可变的热能包括随时间改变所述热能。在一些方面，所述可变的热能随时间周期性变化。在一些方面，所述可变的热能包括多个离散的温度变化。在一些方面，所述可变的热能包括连续的温度变化。在一些方面，所述测定温度是所述多个分隔体积中的分隔体积中存在的温度。在一些方面，将可变的热能施加到所述多个分隔体积在1分钟至90分钟、5分钟至60分钟、10分钟至30分钟或10分钟至20分钟的时间段内发生。在各个方面，所述测定温度选自：35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃或90℃。在各个方面，所述发色团是荧光发色团。在一些方面，所述发色团包含嵌入染料。在各个方面，每个分隔体积具有不超过100nl、不超过50nl、不超过25nl、不超过10nl、不超过9nl、不超过8nl、不超过7nl、不超过6nl、不超过5nl、不超过4nl、不超过3nl、不超过2nl或不超过1nl的体积。在各个方面，可以基于所述靶分子的解链温度确定所述靶分子中的突变的存在。在各个方面，可以基于所述靶分子的解链温度诊断患者。通过引用并入在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，达到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地被指明通过引用并入的相同程度。附图简述在所附权利要求书中特别阐述了本发明的新特征。通过参考以下阐述利用本发明的原理的说明性实施方案的详细说明和附图，将更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：图1显示了根据实施方案的采用编码颗粒的数字核酸扩增方法，如数字pcr的示意图。图2显示了根据实施方案的数字核酸扩增方法，如数字pcr的示意图，其采用关于光谱强度的编码颗粒。图3显示了根据实施方案的数字核酸扩增方法，如数字pcr的示意图，其采用就光谱强度编码的聚合物点。图4显示了根据实施方案的数字核酸扩增方法，如数字pcr的示意图，其采用就光谱强度编码的包含一个或多个猝灭剂的颗粒。图5显示了根据实施方案的数字核酸扩增方法，如数字pcr的示意图，包括sio2/聚合物-p点。图6a显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括探针的结合区的聚合酶诱导的裂解(例如，通过聚合酶的核酸外切酶活性)。图6b显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和杂交来增加探针的编码颗粒与猝灭剂之间的距离。图6c显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交来增加猝灭剂与探针之间的距离。图6d显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交来增加猝灭剂与探针的编码颗粒之间的距离。图6e显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交以及探针内扩增和杂交来增加猝灭剂与探针之间的距离。图6f显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交以及探针内和探针间扩增和杂交来增加猝灭剂和探针之间的距离。图6g显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交，以及来自游离引物的增强扩增和探针内扩增和杂交来增加猝灭剂和探针之间的距离。图6h显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交，以及来自游离引物的增强扩增和探针内和探针间扩增和杂交来增加猝灭剂和探针之间的距离。图6i显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过聚合酶诱导的分子裂解来增加探针和猝灭剂之间的距离。图6j显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交以及探针间杂交来增加猝灭剂和探针之间的距离。图6k显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括通过扩增和竞争性杂交，以及来自游离引物的增强扩增以及探针内和探针间扩增和杂交来增加猝灭剂和探针之间的距离。图6l显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括多个探针的结合区的杂交。图6m显示了根据实施方案的数字核酸扩增，如数字pcr中的步骤的示意图，包括滚环扩增。图7a显示了根据实施方案的sio2/聚合物-p点(实线)和sio2/聚合物-p点-dna(虚线)的吸收光谱。图7b显示了根据实施方案的sio2/聚合物-p点(实线)和sio2/聚合物-p点-dna(虚线)的发射光谱。图8a显示了根据实施方案的每个sio2/聚合物-p点-dna纳米颗粒的杂交的染料缀合的dna(tamra-dna)浓度与检测到的荧光发射的关系。图8b显示了计算值，其说明了根据实施方案的每个sio2/聚合物-p点-dna纳米颗粒的杂交的染料缀合的dna(tamra-dna)浓度与检测到的荧光发射的关系。图9a显示了根据实施方案的在扩增之前的pcr测定的分隔体积。图9b显示了根据实施方案的在扩增之后的pcr测定的分隔体积。图9c显示了根据实施方案的在pcr测定期间记录的原始数据。图9d显示了根据实施方案的来自pcr测定的分析数据。图9e显示了根据实施方案的负载来自pcr测定的样品的1％琼脂糖凝胶的荧光图像。图10a显示了根据实施方案的在扩增之前的数字pcr测定的分隔体积。图10b显示了根据实施方案的在扩增之后的数字pcr测定的分隔体积。图11a显示出了根据实施方案的用于进行数字解链曲线测定的系统的元件。图11b显示了根据实施方案的来自数字空间解链曲线测定的模拟结果。图12a显示了根据实施方案的用于检测hpv(人乳头瘤病毒)45、hpv16和hpv18的三种类型的sio2/聚合物-p点-dna的吸收光谱。图12b显示了根据实施方案的用于检测hpv(人乳头瘤病毒)45、hpv16和hpv18的三种类型的sio2/聚合物-p点-dna的发射光谱。图12c显示了根据实施方案，对于三种类型的sio2/聚合物-p点-dna，缀合到各自p点(p点540、p点610、p点450)的各个核酸(hpv45或仅45；hpv16或仅16；hpv18或仅18)的数目的凝胶电泳表征。图12d显示了根据实施方案，在数字核酸扩增后，三种类型的sio2/聚合物-p点-dna被bhq-dna猝灭的表征，其显示出高水平的猝灭，并因此显示了它们产生高信噪比的能力。图12e显示了根据实施方案在三种类型的sio2/聚合物-p点-dna的pcr测定期间记录的原始数据，说明在hpv16、hpv18和hpv45的检测中的高信噪比。图12f显示了在hpv16、hpv18和hpv45的检测中，三种类型的sio2/聚合物-p点-dna在扩增之前和之后的pcr测定的分隔体积(在uv照射下)以及凝胶电泳结果，显示存在各自的扩增产物。图12g显示了根据实施方案的分隔体积中的数字pcr实验的结果，所述实验在hpv18的检测中使用p点610-hpv18sio2/聚合物-p点-dna，以及在473nm处激发。图12h显示了根据实施方案的单个p点的成像和解码(ex：使用的激发光；em：使用的发射滤波器)。图13显示了在对照和交联条件下进行的探针间杂交实验期间从三个荧光颜色通道获得的数据的单独图像和合并图像。图14显示了p点-dna探针的配对探针间杂交。图15a显示了在约39℃的温度下来自pcr扩增装置的荧光信号。图15b显示了在约55℃的温度下来自pcr扩增装置的荧光信号。图15c显示了在约72℃的温度下来自pcr扩增装置的荧光信号。图15d显示了在空间解链曲线实验期间获得的数据的量化。图16a显示了分别在约23℃、39℃、50℃、59℃和73℃下(从顶部到底部)来自pcr扩增装置的部分的荧光信号。图16b显示了来自图16a的温度分布图像的线扫描的叠加。详述本发明涉及使用包含编码颗粒的分隔体积和探针进行数字测定的方法和系统。特别地，本发明描述了用于改善系统中的靶分子的数字分析(例如，确定目标分子或分析物的存在、身份或浓度)的方法、系统和装置，其包含多个具有相同尺寸、大致相同尺寸或不同尺寸的分隔体积(例如，小滴、等分试样等)。例如，所述方法和系统可以用于确定(1)分隔体积的体积，和(2)分隔体积的数量，在所述分隔体积中可以检测可检测信号或代码，所述(1)分隔体积的体积和(2)分隔体积的数量随后可以用于确定样品的浓度。与传统测定(例如，模拟测定)相比，本文描述的用于数字分析的方法、系统和装置能够改善靶分子的分子水平询问的速度、动态范围和再现性，并增加可以在单一测定中分析的靶分子物质的量(例如，不同类型的靶分子的数量)。特别地，与数字分析的常规方法和系统相比，通过靶分子或与靶分子的存在相关的分隔体积中的分子的扩增，本发明的方法、系统和装置可以改善以其确定靶分子的存在、不存在、身份或浓度的速度、准确性和计算效率。如本文所述，靶分子(或与分隔体积中的靶分子的存在相关的分子，如靶分子的扩增产物)的扩增可以用于调节数字测定中可检测信号或代码(例如，光学可检测信号或代码)的检测，从而改善数字测定的速度、准确性和可靠性。如本文所述，数字测定可以包括将样品(或其衍生物)划分、等分或以其他方式分离成多个分隔体积，单独评价所述多个分隔体积的可检测信号或代码(例如，检测由发色团或由探针的编码颗粒产生的可检测信号或代码)的存在或不存在，和将二进制值分配给每个被评价的分隔体积。在一些情况下，可以基于分隔体积中的可检测信号或代码(或其部分)的存在、不存在、波长、强度和/或寿命，将值分配给分隔体积。分配给被评价的分隔体积的值可以用于确定每个分隔体积中靶分子的特征。例如，在分隔体积中检测到或未检测到可检测信号(例如，可检测代码或其方面)可以指示分隔体积中的靶分子的存在或不存在，并且可以用于确定样品中的靶分子浓度。在一些情况下，在分隔体积中检测到或未检测到可检测信号可以用于确定分隔体积中的靶分子的核酸序列。如本文所述，可检测信号或代码可以由分隔体积中的探针(或其部分)产生，并且可以包括各个方面，例如发射强度(例如，发射峰强度或发射强度范围)、发射波长(例如，发射峰波长或发射波长范围)、发射寿命、激发波长(例如，激发峰波长或激发波长范围)、吸收波长(例如，吸收峰波长或吸收波长范围)或光谱强度。因此，检测可检测信号或代码(例如，光学可检测信号或代码)可以包括测量发射强度(例如，发射峰强度或发射强度范围)、发射波长(例如，发射峰波长或发射波长范围)、发射寿命、激发波长(例如，激发峰波长或激发波长范围)、吸收波长(例如，吸收峰波长或吸收波长范围)、光谱强度或其任意组合。在一些情况下，光谱强度可以包括例如多个发射峰强度、发射峰波长、发射强度范围、发射波长范围、发射波长谱、激发峰波长、激发波长范围、吸收峰波长或吸收波长范围的比率。例如，检测或确定包含两个发色团的探针的光谱强度可以包括检测或测量在两个或更多个波长处(例如，在两个或更多个波长范围内)由探针产生的可检测代码的发射强度，和任选地计算在其检测或测量强度的两个或更多个波长处的强度(例如，强度范围)的比率。可检测信号或代码可以是光学可检测信号或代码(例如，发光或荧光可检测信号或代码)。在一些情况下，可检测信号或代码可以包括波长或波长范围，其包括200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、2000nm或在其任何两个值所限定的范围内的至少一个波长。本文公开了调节数字测定中的探针的可检测信号或代码的新方法和系统。在一些情况下，如本文所述，可检测信号或代码的调节可以取决于靶分子是否存在于包含探针的分隔体积中。例如，在一些情况下，能够调节分隔体积中的探针的编码颗粒的可检测代码或信号的扩增事件可能需要靶分子存在于分隔体积中。因此，可检测到的代码或信号或其任何方面(例如，发射峰强度、发射强度范围、发射峰波长、发射波长范围、激发峰波长、激发波长范围、吸收峰波长、吸收波长范围、发射寿命或光谱强度)可以用于确定靶分子的存在或不存在。因此，本文所述的方法和系统可以例如通过调节分隔体积中存在的探针的编码颗粒发射的可检测信号或代码，作为确定或指示分隔体积中的一种或多种独特靶分子的存在或不存在的手段，用于促进数字测定。本发明的方法和系统通过例如在数字测定中使用分隔体积(例如，数字化体积)有利地实现样品的高通量分析性能。由于基于扩增的检测方法，例如pcr，可以受到同时发生的单个反应之间的相互作用(例如竞争)的影响，因此通过使用数字形式隔离分析试剂和限制反应之间的相互作用，(例如在数字pcr中)使用分隔体积可以改善基于扩增的测定的效率。通过采用多个分隔体积的高通量分析(例如，通过数字化体积的多路复用)，可以在不牺牲反应效率的情况下(例如，由于反应之间的相互作用)就样品中的靶分子浓度进行统计上稳健的计算。通过利用非常小的分隔体积，即小于20pl、小于15pl、小于10pl、小于5pl、小于4pl、小于3pl、小于2pl或小于1pl的体积，进一步增强了这样的通过隔离分析试剂和/或靶分子使相互作用最小化。高通量分析可以包括使用本文所述的多路复用系统，也可以用于快速询问来自患者样品的多个独特靶分子(例如，多个不同类型的靶分子)。在一些情况下，多个独特靶分子中的每个独特的靶分子可以与所述多个独特分子中的每个其他独特分子不同(例如，可以包含与之不同的核酸序列)。就每个样品可以询问的靶分子数量而言以及就可在共同的一组被检查靶分子之间进行比较的受试者数目而言，患者来源的靶分子的这样的高通量筛选可以用于改善临床筛查效率(例如，用于病毒感染、基因状况或临床相关代谢物的数值定量)。因此，本文所述的方法和系统可以通过确定患者样品中是否存在一个或多个靶分子，以及如果存在则确定患者样品中的靶分子的浓度，用于患者的诊断和/或治疗。如本文所使用的，术语“独特”是指不相同的信号、代码、量度、分子、结构、组分或其部分。例如，数字测定可以包括分析两种独特靶分子(例如，在结构上与第二靶分子不同的第一靶分子)。也就是说，两种独特分子(或其片段)可以是不同类型的分子或不同种类的分子。相比之下，单一类型或种类的分子的其他实例或拷贝不一定是独特分子。用于检测靶分子的方法如本文所述，与样品的靶分子(或样品的多个独特靶分子)有关的各种特征可以通过由样品产生的多个分隔体积的数字分析来确定，其中分隔体积中的至少一些包含靶分子。例如，通过确定多个分隔体积中的每个分隔体积中每种独特的靶分子的存在或不存在，可以实现有效和准确地计算样品中每种独特的靶分子的浓度。在一些情况下，确定分隔体积中靶分子的存在或不存在可以包括检测分隔体积中包含的探针的可检测信号或代码。在一些情况下，由探针产生(例如，发射)的可检测信号或代码可以是可调节的(例如，通过分隔体积中包含的猝灭剂对可检测信号或代码的有条件猝灭)。换言之，在样品或其部分中(例如，在源自包含靶分子的样品的分隔体积中)检测靶分子可以包括检测由样品或其部分中存在的探针产生的可调节的可检测信号或代码。如本文所述，探针可以包含编码颗粒和结合区。编码颗粒可以包含发色团，并且编码颗粒的发色团能够发射可检测信号或代码，如本文进一步所述。在一些情况下，可以调节编码颗粒的可检测信号或代码。在一些情况下，可以降低或消除检测器检测编码颗粒的可检测信号或代码的能力。例如，如果猝灭剂与编码颗粒相邻或紧密接近，则与其中猝灭剂不存在或不与编码颗粒紧密接近的情况相比，猝灭剂可以降低检测器(例如，通过动态猝灭机制)可以检测到的可检测信号或代码的强度。因此，可以通过调节猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团之间的距离，来调节可以从分隔体积中的探针、编码颗粒或发色团检测到可检测信号或代码的程度。例如，如果猝灭剂能够与能够产生可检测信号或代码的探针的结合区域杂交或结合，则可以降低或消除检测器检测或测量可检测信号或代码的能力。在一些情况下，探针可以包含猝灭剂。猝灭剂可以包含能够与探针的结合区、靶分子、靶分子的扩增产物或其部分杂交的核酸序列。在一些情况下，猝灭剂可以与探针的结合区结合或杂交。在一些情况下，猝灭剂与探针或其部分(例如，探针的结合区或其部分)的杂交可以将猝灭剂锚定在足够紧密接近探针或其部分(例如，至探针的编码颗粒)处，以降低或消除检测器检测或测量探针或其部分的可检测信号或代码(例如，编码颗粒的可检测信号或代码)的能力。本文描述了方法和系统，其可用于调节包含样品的靶分子的分隔体积中的猝灭剂和可检测信号或代码源(例如，探针、编码颗粒或发色团)之间的距离。在一些情况下，调节分隔体积中的猝灭剂和相同分隔体积中的可检测信号或代码源之间的距离可以取决于分隔体积中的靶分子(或与靶分子的存在相关的分子)的存在或不存在。例如，在一些情况下，猝灭剂和靶分子可以各自与探针的相同结合区杂交或结合，或与探针的相同结合区的部分杂交或结合。在这样的情况下，靶分子可以与猝灭剂竞争与探针的结合区结合或杂交的机会。根据每个分隔体积中靶分子的浓度，来自每个分隔体积的可检测信号或代码的强度可以取决于给定分隔体积中靶分子的存在。如本文所使用的，与靶分子的存在相关的分子可以是靶分子或其部分的扩增产物、靶分子的片段、被靶分子稳定的分子或复合物或需要靶分子的存在以形成或表达的分子。如本文所述，如果猝灭剂介导的信号调节与能够(例如通过竞争性结合)从探针、编码颗粒或发色团附近置换猝灭剂的分子的扩增偶联，则可以显著改善猝灭剂介导的靶分子依赖性信号调节的效率。例如，可以使用热循环扩增或等温扩增来增加能够竞争性抑制猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区关联的部分数目。如本文所述，能够竞争性地抑制猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区关联的部分可以包含靶分子、由靶分子产生的扩增产物(其可例如包含与靶分子的核酸序列互补的核酸序列)、滚环扩增的产物或与靶分子的存在相关的其他分子。如果用于扩增的模板分子或触发分子是靶分子或与靶分子的存在相关的分子，则可以大大提高实现猝灭剂-结合区关联的竞争性抑制的速度。因此，靶分子扩增可以有效增加分隔体积中能够竞争性抑制猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区关联的分子数量。预期不包含靶分子的分隔体积将不会以相同的程度或相同的效率抑制猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区的关联。因此，使用靶分子依赖性扩增来增加猝灭剂与能够发射可检测信号或代码的探针、编码颗粒或发色团之间的距离，可以显著改善检测数字测定的分隔体积中靶分子的存在或不存在的能力。因此，使用本文所述的方法和系统，可以通过引入用于靶分子依赖性扩增的手段来改善数字测定效率和准确性。数字测定效率和稳健性也可以通过形成探针或编码颗粒的网络来提高。增加多个相似的可检测信号或代码的空间集中度可以改善可以在数字测定中检测可检测信号或代码的效率。例如，探针网络，其中网络的多个探针各自包含能够发射彼此相同的可检测信号或代码的编码颗粒，在分隔体积中比来自包含编码颗粒的单个探针的可检测信号或代码更容易被检测到。在一些情况下，可以通过探针的一个或多个结合区与一个或多个其他探针的结合区的关联或杂交来形成探针网络(例如，如图6f、图6g、图6h、图6j、图6k或图6l中示出的)。在一些情况下，提高检测分隔体积中的信号的效率可以提高询问多个分隔体积的可检测信号或代码的存在的速度。因此，如果多个类似或相同的可检测信号或代码例如由于多个探针的聚集或关联而在空间上在分隔体积中集中，则对分隔体积中的靶分子的存在的评估可以更有效地进行(例如，如图6f、图6g、图6h、图6j、图6k或图6l中)。在一些情况下，形成探针或编码颗粒的网络可以包括使多个探针或编码颗粒彼此关联。在一些情况下，形成编码颗粒的网络可以包括靶分子依赖性扩增步骤，如本文所述。在一些情况下，形成探针或编码颗粒的网络可以包括使第一探针的结合区与第二探针的结合区关联、结合或杂交(例如，探针间杂交)。猝灭剂数字测定可以包含猝灭剂。在一些情况下，探针的可检测代码(例如，光学可检测代码)可以通过接近猝灭剂来调节。猝灭剂可以包括能够(例如，通过动态猝灭机制或通过偶极-偶极机制)吸收由另一个分子产生的电磁发射的分子。例如，猝灭剂可以包含能够吸收荧光光谱中的发射能量的化学信号猝灭剂，如blackhole(例如，来自sigma-aldrich的bhq-1、bhq-2或bhq-3)。在一些情况下，猝灭剂可以抑制宽范围波长的检测。例如，在一些情况下，猝灭剂可以抑制由编码颗粒或发色团发射的所有波长峰的检测。在一些情况下，猝灭剂仅可以抑制由编码颗粒或发色团产生的部分发射波长峰的检测。在一些情况下，猝灭剂不能抑制由探针的发色团或编码颗粒发射的任何波长。例如，探针可以包含多个发色团，并且猝灭剂可以不抑制构成探针的每个发色团的检测。猝灭剂可以包含多核苷酸序列(例如，核酸链)。在一些情况下，包含猝灭剂(例如，猝灭剂引物或猝灭剂链)的核酸能够与另一个分子，如靶分子、扩增产物(例如，扩增子或扩增产物，如核酸pcr产物)或探针的结合区杂交。猝灭剂还可以包含多肽序列。在一些情况下，包含猝灭剂的多肽(例如，猝灭剂抗体)可以与另一个分子，如靶分子、扩增产物或探针的结合区(例如，探针的结合区的部分)杂交。在一些情况下，猝灭剂可以与探针的结合区的部分关联(例如，结合或杂交)。包含核酸序列的猝灭剂能够与探针的结合区的部分杂交(例如，互补)，其中所述结合区包含核酸序列。在一些情况下，猝灭剂与探针的结合区的关联可以抑制探针、编码颗粒或发色团的可检测信号或可检测代码的检测。在一些情况下，与探针的结合区的部分关联(例如，杂交或结合)的猝灭剂可以在数字测定的扩增步骤期间延伸。在一些情况下，与探针的结合区的部分关联(例如，杂交或结合)的猝灭剂在数字测定的扩增步骤期间不延伸。猝灭剂可以连接或关联到编码颗粒。例如，猝灭剂可通过核酸分子、结合区、接头、适体或其他这样的分子结合于(例如，拴系于)编码颗粒。在一些情况下，猝灭剂可以通过核酸分子、结合区、接头、适体或其他这样的分子共价结合于编码颗粒。在pcr扩增步骤期间，猝灭剂可以通过聚合酶(例如，聚合酶)，由该酶的核酸外切酶活性与编码颗粒分离。例如，可以裂解或破坏结合区的部分，所述结合区的部分通过聚合酶介导的机制将猝灭剂连接到探针(例如，如图6a中所示)。如果猝灭剂与编码颗粒相邻、关联或以另外的方式紧密接近，则该猝灭剂可以吸收编码颗粒发射的能量(例如，由编码颗粒产生的光学可检测代码)的至少一部分。包括能够与探针的结合区杂交或结合的核酸猝灭剂的猝灭剂可以使编码颗粒的可检测代码降低到数字测定系统的检测限以下，或用于数字测定分析的阈值以下。例如，紧密接近编码颗粒的猝灭剂可以使光学可检测代码的光谱强度降低到数字测定中使用的阈值以下，以指示分隔体积中的靶分子的存在。在一些情况下，可以通过产生能够与猝灭剂竞争与探针的结合区关联的机会的另一种分子来增加猝灭剂与编码颗粒之间的距离(例如，可以从编码颗粒的附近去除猝灭剂)。例如，分隔体积中的分子的扩增可以抑制猝灭剂与探针的结合区关联的能力。在一些情况下，通过增加对探针的结合区的竞争性结合(例如竞争性杂交)，扩增分隔体积中的分子可以导致猝灭剂与编码颗粒之间的距离增加(例如，由于扩增产物与猝灭剂能够结合的探针的部分结合)。包括使分隔体积经历多个热循环的pcr相关的扩增可以用于例如通过竞争性杂交来增加探针或编码颗粒与猝灭剂之间的距离。等温扩增还可用于例如通过竞争性杂交来增加探针或编码颗粒与猝灭剂之间的距离。因此，在靶分子或与靶分子的存在相关的分子不存在的情况下，猝灭剂可以用于降低对探针(例如，编码颗粒)的光学可检测代码的检测。此外，以本文所述的组合物和方法为特征的数字测定的实施方案可以用于在靶分子存在下(例如，当一个或多个探针、猝灭剂和靶分子各自包含在分隔体积中时)直接或间接引起猝灭剂与编码颗粒之间的距离的增加。数字测定中的扩增扩增步骤可以用于调节数字测定的分隔体积中的可检测信号或代码的检测。如本文所述，扩增(例如，扩增步骤)可以包括核酸合成、核酸延伸(例如，通过聚合酶活性延长核酸)、核酸退火到另一种分子(例如，到另一种核酸)或解链(例如，通过温度调节使彼此结合或杂交的第一核酸与第二核酸分离)。在一些情况下，扩增(或扩增步骤)可以包括产生存在于分隔体积中的分子的一个或多个拷贝或分子的部分的一个或多个拷贝。在一些情况下，扩增可以包括产生靶分子的一个或多个拷贝。在一些情况下，扩增可以包括产生靶分子的部分的一个或多个拷贝。在一些情况下，扩增可以包括产生与靶分子相关的分子，如靶分子的扩增产物的一个或多个拷贝。例如，核酸的扩增可以包括产生一个或多个具有与靶分子或其部分互补的序列的分子(例如，靶分子的扩增产物)。在数字测定中的靶分子依赖性扩增步骤或扩增事件(例如，通过聚合酶延伸多核苷酸)可以导致猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区之间的距离增加。在一些情况下，增加猝灭剂与探针、编码颗粒或发色团的结合区之间的距离可以(例如，通过降低信号或代码的猝灭)提高检测器检测编码颗粒或发色团的可检测信号或代码的能力。如本文所述，多种方法和组合物可以用于在数字测定中导致靶分子依赖性扩增以及猝灭剂和编码颗粒或发色团的分离。扩增还可以包括分隔体积中的分子的修饰。例如，扩增(或扩增步骤)可以包括在分隔体积中延伸分子。在一些情况下，延伸分子可以影响分子与分隔体积中的另一个分子杂交、结合或关联的能力。例如，扩增可以包括延伸探针的一个或多个结合区，以使延伸的结合区能够与另一个探针的结合区(例如，延伸的结合区)结合或杂交。在一些情况下，第一探针的结合区与第二探针的结合区之间的结合或杂交可以导致第一和第二探针彼此关联(例如，栓系在一起或在空间上彼此关联)。在一些情况下，延伸多个探针的一个或多个结合区可以导致所述多个探针以该方式彼此关联(例如，相互杂交或网格化)以形成探针的网络。包括聚合酶介导的裂解的扩增在一些情况下，扩增(或扩增步骤)可以包含分隔体积中的分子的裂解或破坏。在一些情况下，分隔体积中的分子的裂解或破坏可以影响分子与分隔体积中的另一个分子杂交、结合或关联的能力。例如，如图6a中所示，探针(例如，荧光探针)可以包含连接(即，通过共价键偶联)到编码颗粒(例如，聚合物点(p点))的猝灭剂。在一些情况下，探针和猝灭剂可以各自共价结合于相同的dna序列。在一些情况下，猝灭剂可以结合于dna序列的5’端，并且探针可以结合于dna序列的3’端。在一些情况下，猝灭剂可以结合于dna序列的3’端，并且探针可以结合于dna序列的5’端。在一些情况下，编码颗粒可以通过一个或多个相同的dna序列(例如，其可以构成探针的结合区的部分)连接到一个或多个猝灭剂。在一些情况下，dna序列可以不相同，并且使用多于一个dna序列可以用于例如通过要求双因素认证使假阳性最小化，或者可以用于辅助多路复用。在一些情况下，一个或多个猝灭剂可以与编码颗粒足够紧密接近，以猝灭由编码颗粒发射的可检测信号或代码的显著部分(例如，当一个或多个猝灭剂与编码颗粒共价结合时)。在一些情况下，一个或多个猝灭剂可以是具有相同吸收光谱的相同类型。在一些情况下，一个或多个猝灭剂可以是具有不同吸收光谱的不同类型。如果来自荧光探针的发射覆盖宽范围的发射波长，则使用不同类型的猝灭剂可以用于帮助更好地猝灭荧光发射。连接猝灭剂和编码颗粒的dna序列可以与靶分子的部分(或靶分子的扩增产物)互补。在一些情况下，靶分子(或靶分子的扩增产物)的互补序列可以在扩增(例如，pcr相关的扩增)期间与探针杂交。如果聚合酶具有核酸外切酶活性(例如，聚合酶)，则当聚合酶从也与靶分子的不同区域互补的引物复制(例如，扩增)核酸(例如，dna或rna)时，聚合酶可以裂解或降解将猝灭剂连接到编码颗粒的dna序列。因此，核酸外切酶裂解过程可以使猝灭剂与编码颗粒分开。一旦在溶液中游离，猝灭剂就可能不足够紧密接近编码颗粒，以有效地猝灭探针的编码颗粒的可检测代码(例如，荧光信号)。当猝灭剂在扩增过程中从编码颗粒裂解时，编码颗粒的可检测代码或信号的一个或多个方面(例如，发射波长、发射寿命、发射强度或一系列强度比，例如通过光谱强度代码所描述的)可以变得对检测器而言足以可检测到超过阈值水平，表明靶分子的存在。在一些情况下，即使在猝灭剂和探针的编码颗粒或任何其他部分之间不存在直接的共价键，猝灭剂和探针的编码颗粒的分离也可包括裂解。例如，如图6i中所示，编码颗粒和猝灭剂包含互补的dna序列(例如，其中猝灭剂(或其部分)的dna序列可以与探针(或其部分)的结合区的dna序列杂交)。猝灭剂的dna序列和结合区的dna序列的杂交可以使猝灭剂与编码颗粒足够紧密接近，以诱导编码颗粒的可检测代码(例如，荧光信号)的降低(例如，猝灭)。在一些情况下，结合区的dna序列、猝灭剂或二者可以与靶分子的部分(或与靶分子的扩增产物的部分)互补。在一些情况下，结合区的dna序列可以与靶分子(或靶分子的扩增产物)的第一部分、靶分子的一条链或靶分子的扩增产物的一条链杂交，并且所述猝灭剂的dna序列可以与靶分子的互补链的第一部分或扩增产物的互补链杂交。在一些情况下，结合区的dna序列可以与和靶分子的第一部分重叠的靶分子(或靶分子的扩增产物)的部分杂交，或与足够接近靶分子(或靶分子的扩增产物)的第一部分的靶分子(或靶分子的扩增产物)的部分杂交，以引起在靶分子(或靶分子的扩增产物)的第一部分处分子杂交的空间抑制。在一些情况下，分隔体积可以包含能够与靶分子(或靶分子的扩增产物)的第二部分杂交的第一引物分子(例如，第一寡核苷酸pcr引物，如图6i的“p1”)，其中所述第二部分可以位于与结合区互补的靶分子的第一部分的下游(即，超过3’端)。在一些情况下，靶分子的第二部分可以位于靶分子的5’端附近。在一些情况下，靶分子的第二部分可以位于靶分子的3’端附近。在一些情况下，靶分子的第二部分可以位于靶分子的5’和3’端之间的50％中心附近。在一些情况下，引物可以与靶分子或扩增产物的区域互补，所述靶分子或扩增产物的区域在与探针或猝灭剂的结合区互补的区域下游(即，在3’端)。分隔体积还可以包含能够与靶分子(或靶分子的扩增产物)的第二部分杂交的第二引物分子(例如，第二寡核苷酸pcr引物，如图6i的“p2”)，其中所述第二部分可以位于靶分子的第一部分的下游(即，超过3’端)，所述靶分子的第一部分与猝灭剂的dna序列互补。在一些情况下，第一和第二引物分子可以通过使用聚合酶的核酸扩增(例如，pcr扩增)来促进靶分子和靶分子的扩增产物的复制。在一些情况下，酶可以具有核酸外切酶活性(例如，聚合酶)。在一些情况下，与探针的结合区或猝灭剂的dna序列杂交的靶分子或扩增产物的扩增(例如，在靶分子或扩增产物的第一区域)可以导致聚合酶介导的结合区或猝灭剂的dna序列或其部分的裂解或降解。结合区或猝灭剂的dna序列或其部分的裂解或破坏(例如，通过聚合酶介导的裂解或降解)可以抑制猝灭剂与编码颗粒关联的能力，其反过来可以限制猝灭剂可以抑制编码颗粒的可检测代码或信号的效率。由于猝灭剂和编码颗粒之间的关联的破坏可以提高检测器检测编码颗粒的可检测代码或信号的能力，因此包含聚合酶介导的结合区的裂解或降解的扩增可以指示分隔体积中靶分子的存在。因此，可以通过数字测定中靶分子依赖性扩增步骤来增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。如本领域技术人员将理解的，针对该机制描述(并且在图6i中示出)的靶分子和靶分子的扩增产物的作用和结合特异性可以切换为相同的效果。此外，并且如本领域技术人员将理解的，在扩增过程中，聚合酶介导的猝灭剂的核酸部分(例如，与探针的结合区互补的猝灭剂的核酸部分)的裂解还可以降低猝灭剂与编码颗粒的关联。包括抑制结合区的自关联的扩增在一些情况下，可以以可逆的方式增加猝灭剂和编码颗粒之间的距离，而无需裂解/降解接头。它可以通过连接猝灭剂和编码颗粒的接头中可逆的构象变化来进行。在一些情况下，猝灭剂可以共价连接到探针的结合区，所述探针的结合区也可以共价连接到探针的编码颗粒。在一些情况下，探针的结合区的第一部分可以与结合区的第二部分杂交。在一些情况下，结合区的第一部分与结合区的第二部分的杂交(例如，结合区的自关联或自杂交)可以导致猝灭剂足够紧密接近编码颗粒，使得猝灭剂部分或完全猝灭编码颗粒的可检测代码或信号(例如，如图6b所示)。在一些情况下，能够彼此杂交的结合区的第一和/或第二部分可以为约6个碱基对的长度。在一些情况下，能够彼此杂交的结合区的第一和第二部分可以位于结合区的近端和远端(即5’端和3’端)，反之亦然。可以位于结合区的第一和第二部分之间的核酸结合区的第三部分可以与靶分子(或与靶分子的扩增产物)互补，并且在与靶分子(或靶分子的扩增产物)杂交时可以形成能够防止结合区自杂交(例如，成发夹结构)的双螺旋结构。在一些情况下，探针的结合区的第三部分可以远长于结合区的第一或第二部分(例如，使得靶分子和结合区的第三部分之间的杂交比结合区的第一部分和结合区的第二部分的杂交在热力学上更有利)。在一些情况下，结合区的第三部分可以与第一和/或第二部分重叠。在扩增期间，可以扩增存在于分隔体积中的靶分子，并且可以进一步扩增靶分子的扩增产物以产生包含与靶分子的核酸序列相同的核酸序列的分子。因此，可以产生足够量的靶分子和/或靶分子的扩增产物，以引起探针结合区域的延伸，并使猝灭剂与编码颗粒分离。因此，可以通过核酸扩增来驱动将猝灭剂连接到编码颗粒的探针的结合区中的发夹结构的打开，以便使猝灭剂与编码颗粒分离。在一些情况下，结合区的该靶分子依赖性延伸可以使猝灭剂和探针的编码颗粒(或发色团)分隔足够大的距离，以使猝灭剂不再能够抑制探针的可检测代码或信号。在一些情况下，然后可以检测到可检测的代码或信号，并且可以将反映靶分子存在的二进制值分配给分隔体积。在一些情况下，不对称扩增可以用于产生与探针的结合区的第一或第二部分互补的单链核酸分子的优势，以抑制结合区的发夹构象。其他扩增方法也可用于产生单链rna(例如nasba)，以抑制结合区自杂交。包括猝灭剂杂交的竞争性抑制的扩增可以通过竞争性抑制具有与猝灭剂的序列互补的序列的探针的结合区的核酸序列之间的杂交，抑制猝灭与编码颗粒的关联。例如，如图6c-6e和6g中所示，探针可以包含与一个或多个结合区共价连接的编码颗粒，所述结合区具有与淬灭剂的dna序列互补的dna序列。在一些情况下，当猝灭剂和结合区的互补dna序列彼此杂交时，可使猝灭剂和编码颗粒彼此足够紧密接近，以实现由编码颗粒产生的可检测的代码或信号(例如，荧光信号)的部分或完全猝灭。在一些情况下，编码颗粒可以与多个能够与猝灭剂的dna序列杂交的结合区共价结合，这可以增加紧密接近编码颗粒的猝灭剂的数目并提高猝灭效率。在一些实施方案中，探针(或其部分)的结合区可与靶分子(或靶分子的扩增产物)的部分杂交和/或充当用于靶分子(或靶分子的扩增产物)的基于pcr的扩增的引物。例如，如图6c中所示，在扩增步骤之前使结合区与靶分子(或靶分子的扩增产物)杂交，其中结合区包含pcr引物(例如，p1)，可导致引物的延伸和/或靶分子(或靶分子的扩增产物)的扩增。在一些情况下，延伸的结合区可以在结合区的位置与分隔体积中存在的第二引物(例如，寡核苷酸pcr引物，例如“p2”，如图6c中所示)杂交，其在结合区(例如，延伸的结合区的部分，其与位于靶分子相对端的靶分子的部分互补，作为与能够结合探针的未延伸的结合区的部分)的延伸过程中合成，因此，p2然后可以被延伸，产生与延伸的结合区的互补序列，其比猝灭剂的核酸序列长得多，因此在杂交期间比猝灭剂的核酸序列更稳定。在一些情况下，所有或几乎所有充当p1的结合区都可以被延伸，并与靶分子或扩增产物的互补部分杂交。在一些情况下，在数字测定中产生的扩增产物(例如，包含与靶分子的部分相同或互补的dna序列的分子)的量可以大大超过分隔体积中的猝灭剂的数量。因为扩增产物可以包含比探针的未延伸的结合区或猝灭剂的核酸序列长得多的杂交区，所以猝灭剂可以优先从探针的结合区移位，从而抑制了猝灭剂与编码颗粒的关联并抑制荧光猝灭。因此，探针的结合区的靶分子依赖性延伸和靶分子(和/或靶分子的扩增产物)的扩增可以导致编码颗粒的可检测代码或信号的猝灭降低。在一些情况下(例如，如图6e中所示)，探针可以包含多个独特结合区(例如，未延伸的结合区)，其可以各自是pcr引物分子(例如，p1和p2)。在一些情况下，结合区中的一个或多个可以包含与猝灭剂的dna序列互补的序列。探针的每个独特结合区也可以包含与靶分子(或靶分子的扩增产物)的部分互补的核酸序列，其在与靶分子(或其扩增产物)杂交时起引物的作用并被延伸(例如，在数字测定的扩增步骤期间)。在一些情况下，延伸的结合区(例如，从p1延伸的)现在可以具有与其它类型的结合区(例如，p2)互补的序列。杂交后，p2结合区也可以被延伸。由于不同结合区的紧密接近，这种探针内杂交可以是有效的，并导致探针内结合区的指数级延伸和扩增。因此，在扩增步骤期间延伸的结合区可以包含与靶分子或靶分子的扩增产物的部分(例如，区域或全部)相同或互补的核酸序列。因此，探针的延伸的结合区可以包含与靶分子(或靶分子的扩增产物)互补的核酸序列，该核酸序列比与猝灭剂的核酸序列互补的结合区的核酸序列更长。因此，探针的延伸的结合区可以与靶分子(或靶分子的扩增产物)杂交，这可抑制猝灭剂与编码颗粒的关联(例如，通过竞争性抑制)。以这种方式，可以通过使用靶分子或其扩增产物作为pcr模板延伸结合区来增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。在一些情况下，起引物作用的结合区可以是那些引物的唯一来源(例如，图6c和6e)。在一些情况下，未共价连接到探针的引物的额外拷贝也可以在溶液中(例如，图6g)。在这种情况下，额外的引物可以促进扩增，使得所有探针分子可以有效地暴露于靶分子或其扩增产物。在一些情况下，能够与探针的结合区关联的猝灭剂可以包含寡核苷酸引物(例如pcr引物)。例如，如图6d所示，猝灭剂可以在分隔体积中与探针的结合区关联。分隔体积还可包含靶分子(或其扩增产物)，其中靶分子(或其扩增产物)的第一端的部分能够与猝灭剂的dna序列关联。在一些情况下，分隔体积还可以包含靶分子(或其扩增产物)，其中靶分子(或其扩增产物)的第一端的部分能够与探针的结合区关联。在一些情况下，并且如图6d中进一步所示，能够与靶分子(或其扩增产物)的第二端关联的寡核苷酸引物(例如pcr引物)可以用于促进靶分子的扩增。以这种方式，可以在能够与猝灭剂关联的数字测定的扩增步骤中产生扩增产物。因为可以在数字测定期间以这种方式产生大量这样的扩增产物，所以可以(例如，通过化学计量式竞争)使分隔体积中的猝灭剂与扩增产物而不是与探针的结合区关联。因为猝灭剂本身可以是pcr引物，所以数字测定的扩增步骤可以导致与扩增产物关联的猝灭剂使用扩增产物作为模板延伸。通过使用扩增产物作为模板来延伸猝灭剂，与和探针的结合区关联的猝灭剂的比例相比，可以进一步增加与扩增产物关联的猝灭剂的比例。因此，可以以靶分子依赖性方式增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。在一些情况下，利用该可检测信号或代码的靶分子依赖性调节的方法可以包括在分隔体积中提供过量的猝灭剂，以确保在靶分子不存在时或在扩增之前将可检测信号或代码完全猝灭。在一些情况下，分隔体积中的猝灭剂的核酸序列、探针的结合区的部分或游离寡核苷酸可以包含用于在数字测定中的核酸扩增的pcr引物。在一些情况下，这些引物类型中的任何一种或全部可以存在于相同的分隔体积中，并且可以包含彼此相同或互补的核酸序列。包括探针内杂交或探针间杂交的扩增可以通过使相同探针的第一结合区的部分与第二结合区的部分关联来增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。在一些情况下，第一结合区可以具有与第二结合区不同的核酸序列(例如，探针可以包含两个独特结合区)。如本文所述，探针的结合区(例如，第一独特结合区、第二独特结合区、第三独特结合区等)可以包含pcr引物。例如，如图6e和图6f中所示，探针可以包含两个独特结合区(例如，两种不同类型的结合区)。在一些情况下，包含探针的分隔体积也可以包含多个猝灭剂。分隔体积的所述多个猝灭剂可以包含一个或多个能够与探针的每个结合区关联的猝灭剂。在一些情况下，所述多个猝灭剂可以包括多个独特猝灭剂。在一些情况下，分隔体积可以包含能够与探针的每个独特结合区关联的独特猝灭剂。在一些情况下，靶分子的部分可以与探针的第一结合区关联。靶分子的扩增产物的部分可以与探针的第二结合区关联。在一些情况下，靶分子(或靶分子的扩增产物)的第一部分能够与探针的第一结合区关联，并且靶分子(或靶分子的扩增产物)的第二部分能够与探针的第二结合区关联。在一些情况下，靶分子或靶分子的扩增产物与探针的结合区的关联可以防止猝灭剂与结合区关联。如图6e和图6f中所示，与探针的结合区关联的靶分子或靶分子的扩增产物可以充当模板(例如pcr模板)，其中结合区可以起引物作用，并且可以发生结合区的延伸。在一些情况下，在扩增步骤过程中延伸的结合区的部分(例如，其中靶分子或靶分子的扩增产物用作结合区延伸的模板)能够与相同探针的另一个结合区关联(例如，如图6e中所示)，导致探针内杂交和扩增。在一些情况下，在扩增步骤期间延伸的结合区的部分能够与另一个探针的结合区或延伸的结合区关联(例如，如图6f中所示)，导致探针间杂交。如图6f中进一步所示，第一探针的多个结合区的第一部分可以与第一探针的多个结合区域的第二部分关联，并且第一探针的多个结合区的第三部分可以与第二探针的结合区的部分关联。在一些情况下，探针的结合区可以与多个其他相同探针或多个其他独特探针关联(例如，杂交或结合)。在图6e和图6f中举例说明的靶分子依赖性扩增的机制中，使用靶分子(或其扩增产物)延伸结合区可以通过竞争性杂交增加淬灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。在一些实施方案中，探针间杂交可以自发发生。例如，在6e和6g中示出的上述条件可以产生探针间杂交(例如，分别在6f和6h中示出)。由于连接到每个编码颗粒的每种引物的确切数目的随机变化和/或由于关于单个编码颗粒内的扩增产物的内部杂交的确切模式的随机变化以及某些共价连接的扩增产物不能与相同编码颗粒内的互补扩增产物配对的可能性，可能发生探针间杂交。在一些情况下，可以在分隔体积中提供能够识别和扩增靶分子的另外的正向和反向pcr引物，以提高扩增靶分子和产生靶分子的扩增产物的效率(例如，如图6g和图6h中所示)。在一些情况下，可以在与探针的结合区关联之前和/或在结合区延伸中用作模板之前通过等温或热循环扩增来增加靶分子的浓度。通过改善产生靶分子或靶分子的扩增产物的拷贝的效率，结合区延伸可以更快地进行，因为在分隔体积中更有效地提供用于结合区延伸的模板。因此，通过增加pcr引物的浓度和/或预扩增靶分子来“增强”结合区延伸模板(例如靶分子和靶分子的扩增产物的拷贝)的产生可以进一步改善探针的结合区彼此关联，或与一个或多个另外的探针的结合区关联的效率。当探针间杂交发生时，信号的产生可以基于荧光信号的一般增加、产生荧光信号的斑点的大小的增加或二者的组合。在一些情况下，可以可视化单个探针，探针间杂交可以产生一个或几个大的聚集信号，而不是由单个探针分子产生的许多小信号。在一些情况下，数字测定的分隔体积可以包含两种独特探针(例如，第一独特探针和第二独特探针)。第一独特探针可以包含与第二独特探针的结合区(例如，第一独特结合区和第二独特结合区)不同的结合区。在一些情况下，探针的结合区可以包含扩增引物(例如，pcr引物)。在一些情况下，靶分子的部分能够与第一独特结合区关联(例如，结合或杂交)。靶分子的扩增产物可以包含核酸序列，其部分能够与第二独特结合区关联。在任一种情况下，靶分子或其扩增产物都可以充当扩增模板，用于延伸第一和第二独特探针的第一独特结合区和/或第二独特结合区，如图6j中所示。因此，数字测定的扩增步骤可以包括第一独特探针的第一独特结合区的延伸和/或第二独特探针的第二独特结合区的延伸。在一些情况下，在第一独特探针的结合区延伸期间合成的第一独特结合区的部分可以与第二独特结合区的部分关联。在一些情况下，在第二独特探针的结合区延伸期间合成的第二独特结合区的部分可以与第一独特结合区的部分关联。如果分隔体积还包含能够与第一独特结合区关联的第一猝灭剂和/或能够与第二结合区关联的第二猝灭剂(例如，如图6j中所示)，第一探针的第一独特结合区与第二探针的第二独特结合区在靶分子依赖性结合区延伸之后关联，则第一猝灭剂和/或第二猝灭剂可以从第一独特结合区和/或第二独特结合区置换。因此，可以通过靶分子依赖性扩增步骤来增加第一猝灭剂与第一独特探针的编码颗粒之间的距离或第二猝灭剂与第二独特探针的编码颗粒或发色团之间的距离。在一些情况下，第一猝灭剂或第二猝灭剂也可以通过靶分子或靶分子的扩增产物与第一独特结合区或第二独特结合区的关联而被置换。在一些实施方案中，探针间杂交的机制(例如，多个探针或编码颗粒的关联或聚集)可以足以产生阳性信号。在这种情况下，如图6l中所示，不需要连接到猝灭分子的互补序列。在可以对单个探针成像的一些情况下，通过探针间杂交的探针聚集导致目标探针的独特聚集。在一些情况下，许多单个探针与一个或几个大的集群/聚集体之间的大小差异可以提供足够的区别以产生阳性信号，并且不需要猝灭。在一些情况下，可以通过仔细选择分隔体积中的一个或多个探针上存在的结合区的数目和类型来优先诱导探针间杂交(例如，如图6k中所示)。如本文所述，分隔体积可以包含多个独特探针，并且探针可以包含多个独特结合区。在一些情况下，第一独特探针可以在包含每个独特探针的独特结合区的比例方面不同于第二独特探针，如图6k中所示。例如，第一独特探针可以包含比例为60:40的第一独特结合区与第二独特结合区，而第二独特探针可以包含比例为40:60的第一独特结合区与第二独特结合区。在一些情况下，探针上的第一独特结合区与第二独特结合区的比例可以为约1:1000至约1:100、约1:100至约1:10、约1:10至约1:5、约1:5至约1:4(例如，20:80)、约1:4至约1:3(例如，25:75)、约1:3至约1:1(例如，50:50)、约2:3(例如，40:60)至约3:2(例如，60:40)、约1:1至约3:1(例如，75:25)、约3:1至约4:1(例如，80:20)、约4:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约100:1或约100:1至约1000:1。在某些方面，第一独特探针上的第一结合区与第二结合区的比例为第二独特探针上的第一结合区与第二结合区的比例的约1倍、约1.05倍、约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约30倍、约40倍约50倍、约60倍、约70倍约80倍、约90倍或约100倍。如本文所述，猝灭剂、靶分子(或其部分)或靶分子的扩增产物(或其部分)可以与探针的结合区关联。在一些情况下，在数字测定的扩增步骤期间，靶分子或靶分子的扩增产物可以在结合区的延伸中起pcr扩增模板的作用。在一些情况下，探针的延伸的结合区可以与相同探针或不同探针的结合区关联，如图6j和图6k中所示。在一些情况下，第一探针的延伸的结合区与第二探针的结合区的关联可以促进探针网络形成。例如，如果第一独特探针包含比例为60:40的第一和第二独特结合区，而第二独特探针包含比例为40:60的第一和第二独特结合区，则在数字测定中扩增之后，与包含比例为50:50的第一独特结合区和第二独特结合区的多个探针相比，分隔体积可以包含探针之间的更多的结合区关联(例如，相对于相同探针上的结合区的关联)。也就是说，通过控制探针中独特结合区的比例，可以限制数字测定中的不包含探针间结合区的探针的数量。因此，分隔体积的两种探针上的第一独特结合区与第二独特结合区的比例可以影响(例如，由于不同程度的探针间关联)数字测定的分隔体积中的可检测信号或代码的检测的强度和空间分布。在一些情况下，探针可以包含第一独特结合区和第二独特结合区。在一些情况下，第一独特结合区不能与第二独特结合区关联。例如，第一独特结合区可能不能与第二结合区的任何部分关联。也就是说，第一独特结合区可以包含与第二独特结合区的任何部分都不互补的核酸序列。然而，在一些情况下，靶分子、靶分子的扩增产物或二者可能能够与第一独特结合区的部分关联。也就是说，靶分子、靶分子的扩增产物或二者可以包含与第一独特结合区的部分互补的核酸序列。靶分子、靶分子的扩增产物或二者可能能够与第二独特结合区的部分关联。也就是说，靶分子、靶分子的扩增产物或二者可以包含与第二独特结合区的部分互补的核酸序列。在一些情况下，靶分子、靶分子的扩增产物或二者的多个区域可能能够与第一独特结合区关联(例如，结合或杂交)。在一些情况下，靶分子、靶分子的扩增产物或二者的多个区域可能能够与第二独特结合区关联(例如，结合或杂交)。因此，靶分子、靶分子的扩增产物或二者可以通过与包含多个独特结合区的两个相同探针的第一独特结合区，包含多个独特结合区的两个相同探针的第二独特结合区，或第一探针的第一独特结合区和与第一探针相同的第二探针的第二独特结合区关联，促进探针网络的形成。这样的靶分子依赖性探针网络形成可以反映分隔体积中的靶分子的存在，并且可以通过信号或代码强度或信号或代码空间大小的增加来测量或确定。在一些情况下，分隔体积中的靶分子的扩增可以促进这样的探针网络的形成。在一些情况下，第一结合区的部分可以包含与第二结合区的核酸序列互补的核酸序列。在一些情况下，形成的探针网络不包含猝灭剂分子或该机制不涉及猝灭剂分子(例如，图6l)。探针网络的形成(例如，探针间杂交，例如图6f、图6h、图6j、图6k和图6l中所示)也可以改善数字测定中的信号检测效率。例如，探针间杂交可以导致分隔体积中的探针的聚集或空间集中(从而导致探针的可检测代码或信号的聚集或空间集中)。分隔体积中的可检测代码或信号的聚集或空间集中可以提高检测器检测分隔体积中的可检测代码或信号的能力(例如，通过增加作为整体的分隔体积内的可检测代码或信号的总体视在强度)。因此，在涉及多路复用数字测定方法的应用中，采用如本文所述的采用探针间杂交的靶分子依赖性扩增方法可以是有利的。在一些情况下，包含核酸扩增的数字测定可以包含探针内杂交(例如，探针的第一独特结合区与探针的第二独特结合区的杂交)和探针间杂交(例如，第一独特探针的结合区与第二独特探针的结合区的杂交)。包括滚环扩增的扩增分隔体积可以包含环化核酸分子。在一些情况下，多个分隔体积中的每个分隔体积包含环化核酸分子。在一些情况下，环化核酸分子可以包含与猝灭剂的核酸序列相同并且与探针或其部分的结合区的核酸序列互补的核酸序列。在如这样的实施方案中，也具有与探针的结合区的部分互补的核酸序列的猝灭剂可以与探针的结合区关联。在一些情况下，当猝灭剂与探针的结合区关联(例如，结合或杂交)时，可以抑制探针的可检测代码或信号的检测。在一些情况下，也可以在分隔体积中提供触发分子，所述触发分子可以包含能够与环化核酸分子的部分杂交的pcr引物。触发分子可以是靶分子或其部分、靶分子的扩增产物或其部分或与靶分子的存在相关的另一分子。在数字测定的扩增步骤过程中，触发分子可以促进环化核酸分子的滚环扩增。滚环扩增的扩增产物可以包含与猝灭剂互补的核酸序列。滚环扩增的扩增产物可以包含多个与猝灭剂互补的核酸序列。因此，猝灭剂可以与滚环扩增反应的扩增产物关联而不是与探针的结合区关联，增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离。滚环扩增反应的扩增产物还可以与探针的结合区关联，竞争性地抑制猝灭剂与探针的结合区的关联。因此，靶分子依赖性滚环扩增反应可以用于数字测定中，以增加猝灭剂与探针的编码颗粒或发色团之间的距离，如图6m中所示。因此，靶分子依赖性滚环扩增可以用于指示分隔体积中靶分子的存在或不存在。数字测定可以包括升高、降低或保持分隔体积的温度。在一些情况下，数字测定的扩增步骤可以包括升高和降低，升高和保持，或降低和保持分隔体积的温度。例如，数字测定的扩增步骤可以包括将分隔体积从室温加热到约95℃的温度，或从约68℃的温度加热到约95℃的温度。扩增步骤还可以包括将分隔体积的温度从约95℃降低至约45℃至约68℃的范围内的温度。扩增步骤还可以包括将分隔体积的温度从约45℃至约68℃的范围内的温度值升高至约95℃的温度。在一些情况下，升高、降低或保持分隔体积的温度的步骤可以重复一次或多次。也就是说，数字测定可以包括一个或多个热循环顺序(例如，温度循环)，其中热循环顺序包括升高、降低或保持(或其任何组合的任何顺序)分隔体积的温度。在一些情况下，数字测定可以包括多个不同的热循环。也就是说，数字测定可以包括第一热循环序列的一个或多个实例和第二热循环序列的一个或多个实例。在一些情况下，数字测定可以包括至少至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或至少45个温度循环。在一些情况下，数字测定可以包括2至5个、5至10个、10至15个、15至20个、20至25个、25至30个、30至35个、35至40个或40至45个温度循环。包括扩增步骤的任何数字测定可包括在多个体积中的每个分隔体积中提供pcr试剂。在一些情况下，多个分隔体积中的仅部分分隔体积包含pcr试剂。分隔体积中提供的pcr试剂可以包括引物、核苷酸、聚合酶和/或缓冲剂。数字测定可以包括各种数字核酸分析方法。在各个方面，本发明提供了用于通过进行数字核酸扩增来扩增的方法、装置和系统。在各个方面，本发明提供了用于通过进行数字pcr(dpcr)来扩增的方法、装置和系统。数字pcr是在pcr扩增一个或多个靶序列之前，将样品中存在的单一核酸分子分布到许多分开的反应体积(例如，可以位于微流体芯片或多孔板的腔室或孔或小滴中的分隔体积)中的方法。调节样品中单一分子的浓度，以使至少一些反应体积不包含靶分子，并且至少一些反应体积包含至少一个靶分子。靶序列的扩增产生二进制数字输出，其中每个腔室被确定为包含或不包含指示相应靶序列存在的pcr产物。包含可检测水平的pcr终产物的反应体积计数是绝对核酸量的直接量度。在本发明的各个方面，通过将核酸样品划分到分开的反应体积(例如，分隔体积)中来分布核酸样品。在一些情况下，随后可以在pcr试剂的存在下对数字化的样品进行热循环(例如，经受热能的循环施加)，从而促进核酸样品的扩增。在一些方面，本发明的设备、装置、方法和系统可以用于扩增多核苷酸样品，例如采用聚合酶链反应(pcr)、逆转录酶pcr(rt-pcr)、连接酶链反应(lcr)、环介导扩增(lamp)、逆转录环介导扩增(rt-lamp)、解旋酶依赖性扩增(hda)、逆转录解旋酶依赖性扩增(rt-hda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、逆转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)、催化发夹装配反应(cha)、杂交链反应(hcr)、熵驱动催化、链置换扩增(sda)和/或逆转录链置换扩增(rt-sda)。在某些方面，本发明的设备、装置、方法和系统可以用于基于核酸序列的扩增(nasba)、转录介导的扩增(tma)、自维持序列复制(3sr)和单引物等温扩增(spia)。可以使用的其他技术包括，例如，信号介导的rna扩增技术(smart)、滚环扩增(rca)、超分支滚环扩增(hrca)、指数扩增反应(expar)、smart扩增(smartamp)、等温嵌合引物引发的核酸扩增(icans)和多置换扩增(mda)。本发明的其他方面、设备、装置、方法和系统可以包括细胞(例如少量细胞或单细胞)的操纵和/或分析，其他生物颗粒(例如分离的线粒体、细菌、病毒颗粒)，或其他生物或化学组分的操纵和/或分析。等温分析在一些情况下，数字测定或其部分可以包含等温步骤、反应或测定。等温步骤、反应或测定可以包括将多个分隔体积中的一个或多个分隔体积保持在特定温度、高于特定温度或低于特定温度。在本发明的另一方面，本文描述的方法、系统和装置可以应用于等温扩增技术，例如数字式基于核酸序列的扩增(nasba)和环介导的等温扩增(lamp)。nasba和lamp是等温扩增方案，开发其以补充pcr。在等温扩增中，可以不需要或不允许温度循环。等温扩增可以包括等温核酸扩增。有几种类型的等温核酸扩增方法，例如转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增、信号介导的rna扩增技术、链置换扩增、滚环扩增、dna的环介导等温扩增、等温多置换扩增、解旋酶依赖性扩增、单引物等温扩增和环状解旋酶依赖性扩增。基于核酸序列的扩增(nasba)是等温扩增方法，其可例如在约40℃下进行。nasba可以包括：高扩增效率和快速扩增动力学，其中在一小时或两小时内可以实现大于一千倍的扩增；假阳性率低；与pcr相比，控制温度的需求和需要的反馈更少。nasba是一种等温方法的事实使其可以使用温控烘箱同时运行多个样品，这在许多应用中是重要的实用优势。环介导的等温扩增(lamp)是能够以高特异性、效率和速度(例如，在约60℃下)扩增dna的一种等温扩增测定。由于其扩增反应的特性，lamp可以实现区分扩增过程中的单个核苷酸差异。因此，lamp可以区分包含与靶分子非常相似但不同的分子的样品，例如基因检测应用。在病毒检测中，lamp还显示出具有比rt-pcr高约10倍的灵敏度。在一个方面，本发明提供了一种用于进行样品的数字环介导的扩增的方法。该方法可包括在微流体装置上产生样品的多个分隔体积，其中多个分隔体积中的至少一个分隔体积包含核酸分子(例如，dna和/或rna分子)；和在至少一个分隔体积中进行环介导的扩增，以产生核酸分子的扩增产物。该方法还可以包括检测扩增产物。在一些方面，该方法包括确定多个分隔体积中的包含扩增产物的分隔体积的数量；和使用多个分隔体积中的单个分隔体积的体积和多个分隔体积中的包含核酸分子的分隔体积的数量，计算样品中核酸分子的浓度。该微流体装置可以包括多个腔室，所述多个腔室被配置成形成多个分隔体积。滚环扩增(rca)可以是等温核酸扩增方法。rca可以在若干方面不同于聚合酶链反应(pcr)和其他核酸扩增方案。靶分子可以充当用于滚环扩增反应的触发分子和/或引物。触发分子或其部分可以退火为小的环状dna模板，并且可以添加dna聚合酶以延伸引物。dna聚合酶可以使引物连续地围绕环状dna模板延伸，产生长的dna产物，该产物可以由环的许多重复的拷贝组成。在反应结束时，聚合酶能够产生环状模板的数千个拷贝。通过使用不同大小的分隔体积的阵列，可以增加采用nasba、lamp和/或rca的数字测量的动态范围。本文所述的方法和系统可以利用这些扩增方案来测量和定量分隔样品(例如，分离到分隔体积中的样品)中rna和dna的存在。在另一方面，该方法可以应用于基于特异性分子识别的扩增。解链曲线分析本发明的另一方面包括用于通过解链曲线分析确定靶分子之间基因变异的存在的方法和系统。基因变异可以包括基因突变、遗传多态性或两个分子之间(例如，对照分子与靶分子之间)的表观遗传学差异。在一些情况下，解链曲线分析可以用于检测、验证或确定工程突变或新生突变，测试接合性，检查核酸分子的表观遗传状态或基于基因序列的存在诊断患者的病症。例如，解链曲线分析测试可以用于快速确定疑似被感染患者感染的病毒的种类、株系或亚型。诊断患者可以基于靶分子的存在、不存在、身份或序列，如通过解链曲线分析或使用本文所述的任何其他方法或系统所确定的。解链曲线分析可以是时间解链曲线分析或空间解链曲线分析。解链曲线分析的原理在于两个双链核酸对之间的解链曲线动力学的差异。和在pcr循环中一样，当在解链曲线分析中加热杂交的核酸对时，杂交的核酸对将开始解链或分离。核酸彼此分离的速率可以取决于例如构成杂交的核酸对的腺嘌呤-胸腺嘧啶(a-t)对和鸟嘌呤-胞嘧啶(g-c)对的相对含量。由于g-c对比a-t对共享更多的氢键，因此当以高分辨率和实时监测解链时，如在时间解链曲线分析过程中观察到的，g-c对可以比a-t对花费稍长的时间来解链。在空间解链曲线分析的情况下，可以跨分隔体积的阵列(例如，一系列芯片或管上的孔、腔、腔室、数字化体积或小滴)建立静态温度梯度(例如，空间温度梯度)。跨多个分隔体积的温度梯度可以导致分隔体积中温度的线性或非线性分布(例如，测定温度的线性或非线性分布)。以这种方式，可以基于解链曲线的动力学或空间图比较两个杂交的核酸对的基因序列。在给定的时间，解链曲线测定中任何两个分隔体积中的温度可以相同。在给定的时间，解链曲线测定中任意两个分隔体积的温度可以不同。在一些情况下，分隔体积的温度(例如，测定温度)可以随时间变化。随时间变化地施加热能可以导致分隔体积的温度随时间变化。在一些情况下，分隔体积的温度可以随时间周期性变化。在一些情况下，分隔体积的温度的周期性变化可以(例如，在分隔体积中)引起靶分子或与靶分子的存在相关的分子的扩增。在时间和空间解链曲线分析中，可以通过监测从分隔体积发射的光谱强度信号来观察杂交的核酸对的解链。例如，杂交的核酸对的解链可以从核酸对的链之间释放可检测试剂(例如发色团，如嵌入染料或荧光团)。在解链期间释放可检测试剂可以导致光谱强度信号降低。光谱强度信号可以由可检测试剂产生，该可检测试剂例如探针的编码颗粒(例如聚合物点)、颗粒(例如发色团颗粒，如聚合物点)、嵌入染料或荧光团。光谱强度可以是荧光信号(例如，荧光发射特征，其可以例如包括发射波长)。在解链曲线分析期间产生的空间或时间解链曲线可以称为解链曲线特征。解链曲线特征可以指示靶分子的组成(例如，核酸序列)(例如，与第二靶分子或分析物分子相比)。因此，基于靶分子的组成，可将解链曲线特征用于诊断患者。在数字测定，如解链曲线分析期间，一次可以从1至约100000、100至约100000、500至约50000、1000至约30000、5至约7500、约10至约5000、约25至约4000、约50至约3000、约10至约100、约50至约200、约100至约2,000、约250至约1000或约500至约800个分隔体积检测到光谱强度信号。可以在约1分钟至约90分钟、约5分钟至约60分钟、约10分钟至约30分钟、约10分钟至约20分钟或约1分钟至约10分钟的时间内进行解链曲线分析。在时间解链曲线分析期间，可以逐步进行杂交的核酸对的加热，以在核酸对的每个部分解链时提供更好的分辨率。解链曲线分析的每个温度步骤可以为约0.01℃至约1.0℃、约0.05℃至约0.5℃、约0.1℃至约0.25℃或约0.15℃至约0.3℃。时间解链曲线测定可以包括在任何温度步骤之前或之后的暂停，例如，以便更清楚地区分解链曲线特征上的光谱强度信号的变化。时间解链曲线测定可以跨约25℃至约100℃、约40℃至约95℃、约48℃至约90℃或约60℃至约76℃的温度范围进行。在一些情况下，时间解链曲线测定可以包括将分隔体积加热到或将分隔体积保持在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃的温度下或在那些值中的任何两个所限定的范围内。可以通过跨多个分隔体积随时间施加可变的热能(例如，可变的量的热能)来进行时间解链曲线测定。随时间将可变的热能施加到多个分隔体积可以包括多个离散的温度梯度或连续的温度变化。可以在分隔体积上进行空间解链曲线测定(例如，静态解链曲线测定)。使用分隔体积的空间解链曲线测定可以在落入以下范围的温度下进行：约25℃至约100℃、约40℃至约95℃、约48℃至约90℃或约60℃至约76℃。在一些情况下，静态解链曲线测定可以括将分隔体积加热到或将分隔体积保持在约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃的温度下或在那些值中的任何两个所限定的范围内。在一些情况下，可以在以二维阵列(例如，诸如微流体或自数字化芯片的腔室或多孔板的孔)排列的多个分隔体积上进行空间解链曲线。在一些情况下，空间解链曲线(或其部分)的二维阵列的第一轴(例如，垂直列)可以包括一系列代表实验重复的分隔体积(例如，用于在归一化或统计分析期间求平均值)。在一些情况下，空间解链曲线(或其部分)的二维阵列的第二轴(例如，水平行)可以包括一系列分隔体积，所述分隔体积经受不同量的热能的施加。在一些情况下，施加到第一分隔体积的热能的量可以导致分隔体积中的温度比第二分隔体积中的温度高0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1℃、0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、0.6℃、0.7℃、0.8℃、0.9℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃(或由那些值中的任何两个所限定的范围)。在一些情况下，可以通过跨分隔体积或其他分隔体积建立温度梯度，并表征单个分隔体积内的空间解链曲线，在单个分隔体积或其他分隔体积上进行静态解链曲线分析。用于数字测定的探针探针可以用于在数字测定中检测、确定或定量靶分子。根据本文所述的方法和系统，数字测定的分隔体积可以包含一个探针或多个探针。分隔体积还可包含多个独特探针。在一些情况下，分隔体积可以包含至少2个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个或至少1000个独特探针。在一些情况下，分隔体积可以包含约2个独特探针、约5个独特探针、约10个独特探针、约20个独特探针、约50个独特探针、约100个独特探针、约200个独特探针、约500个独特探针、约1000个独特探针或前述的探针量中的任意两个限定的范围内的多个探针。在一些情况下，探针可以位于包含靶分子的分隔体积中。在一些情况下，探针可以位于不包含靶分子的分隔体积中。在一些方面，本文所述的方法包括使包含靶分子的样品与探针的悬浮液接触。在一些情况下，用探针检测、确定和/或定量靶分子可包括使靶分子与探针接触。在一些情况下，用探针检测、确定和/或定量靶分子可包括使与靶分子的存在相关的分子与探针接触。探针可以包含能够发射可检测信号或代码的发色团或编码颗粒(例如，聚合物点，如编码的发色团聚合物点)。在一些情况下，探针可以包含多个发色团或编码颗粒(例如，聚合物点)。例如，探针可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10至20个、20至50个、50至100个或多于100个不同的发色团或编码颗粒。在一些情况下，探针的第一发色团或编码颗粒可以产生与探针的第二发色团或编码颗粒不同的可检测代码或信号。例如，探针的第一发色团或编码颗粒可以产生与探针的第二发色团或编码颗粒产生的信号具有不同的发射强度，但处于相同的波长下或在相同的波长范围内的信号。在一些情况下，探针的第一发色团或编码颗粒可以能够在一波长下或在一波长范围内产生发射强度大于阈值的信号，所述波长或波长范围不同于探针的第二发色团或编码颗粒能够产生发射强度大于阈值的信号时所处的波长或波长范围。在一些情况下，探针的发色团或编码颗粒的可检测信号或代码可以是光学可检测信号。发色团或编码颗粒的可检测代码或信号可以是荧光信号。例如，包含聚合物点的探针的可检测代码或信号可以包括聚合物点发射的荧光信号。探针能够产生的可检测代码或信号可以包括一个或多个构成探针的发色团或编码颗粒的(多种)可检测代码或(多种)信号(例如，(多种)光学可检测代码或(多种)信号)。在一些情况下，探针能够产生的可检测代码或信号可以取决于构成探针的发色团或编码颗粒的数量和类型。在一些情况下，第一探针能够产生的可检测代码或信号可以不同于第二探针能够产生的可检测代码或信号。在一些情况下，第一探针能够产生的可检测代码或信号可以不同于第二探针能够产生的可检测代码或信号，因为第一探针包含与第二探针所包含的不同的一组发色团或编码颗粒。例如，由包含第一和第二类型的发色团(例如，能够产生第一和第二光学可检测代码或信号的第一和第二发色团)的第一探针产生的可检测代码或信号可以不同于由包含第三和第四类型的发色团(例如，分别能够产生第三和第四光学可检测代码或信号的第三和第四发色团)的第二探针产生的可检测代码或信号。在一些情况下，可以将能够产生第一可检测代码或信号的第一探针与能够产生第二可检测代码或信号的第二探针区分开。例如，在一些情况下，如果第一探针产生的可检测代码与第二探针产生的可检测代码不同，则可以将第一探针与第二探针区分开。在一些情况下，第一探针可以产生第一可检测代码或信号，第二探针可以产生与第一可检测代码或信号不同的第二可检测代码或信号这一事实可用于数字测定，以区分分隔体积中的第一靶分子和第二靶分子的存在。由探针的编码颗粒或发色团发射的可检测信号或代码可以通过猝灭剂来调节。在一些情况下，猝灭剂对可检测信号或代码的调节可以取决于猝灭剂与能够发射可检测代码或信号的编码颗粒或发色团的接近度。探针还可以包含猝灭剂，其可以降低由编码的颗粒或其他发色团产生的可检测信号或代码的强度。猝灭剂可以包含核酸序列。在一些情况下，核酸序列可以与以下一种或多种互补(例如，能够与之杂交、结合或关联)：i)探针(或其部分)的结合区，ii)靶分子(或其部分)，或iii)靶分子(或其部分)的扩增产物。在一些情况下，猝灭剂可以直接共价结合到探针的编码颗粒。在一些情况下，猝灭剂可以通过接头分子结合到探针的编码颗粒。探针也可以包含结合区。探针可包含核酸(例如，多核苷酸)、多肽或其组合。探针可包含被配置成识别靶分子的结合区。也就是说，探针的结合区可以被配置成与靶分子结合、杂交或以其他方式关联。探针可以包含1至约5个、约5至约20个、约20至约50个、约50至约75个、约75至约100个、约100至约150个、约150至约200个、约200至约250个结合区、约250至约300个结合区、约300至约350个结合区、约350至约400个结合区、约400至约450个结合区、约450至约500个结合区或约500至约1000个结合区。探针的结合区可以包含多核苷酸、序列、引物核酸分子、模板核酸分子、蛋白、接头或适体。探针的结合区可以(例如，共价或非共价地)连接到另外的分子。在一些情况下，探针的结合区可以共价或非共价地连接到猝灭剂。结合区(或其部分)还可以与pcr引物、靶分子或扩增产物(例如，靶分子的扩增产物)关联(例如，结合或杂交)。在一些情况下，探针的结合区可以是pcr引物或pcr引物的部分。在一些情况下，探针的结合区可以是pcr模板或pcr模板的部分。在一些情况下，结合区的第一区域可以与相同结合区的第二区域关联(例如，结合或杂交)。在一些情况下，第一结合区可以与相同探针上的第二结合区关联(例如，结合或杂交)。在一些情况下，探针的两个独特结合区(例如，第一独特结合区和第二独特结合区)可以彼此关联。在一些情况下，第一类型的探针(例如，第一独特探针或第一种类的探针)的结合区可以与第二类型的探针(例如，第二独特探针或第二种类的探针)的结合区关联(例如，结合或杂交)。在一些情况下，第一探针的第一独特结合区可以与第二探针的第二独特结合区关联。探针可用于直接或间接检测、确定或定量靶分子。例如，在dpcr中，探针可以通过与靶分子的扩增产物(例如，扩增子)的杂交来间接指示靶分子的存在。本发明还提供了使用本文所述的编码颗粒的方法。例如，本发明提供了用于多种应用的基于荧光的检测方法，其使用作为一类荧光探针的编码颗粒及其生物缀合物。这些包括但不限于免疫荧光、免疫组织化学、荧光多路复用、dna和基因分析、蛋白质分析、代谢物分析、脂质分析、基于共振能量转移(fret)的传感器、高通量筛选、细胞检测、细菌检测、病毒检测、生物标志物检测、细胞成像、体内成像、生物正交标记、基于荧光的生物学测定如免疫测定和基于酶的测定以及生物学测定和测量中的各种荧光技术。在某些方面，本文的编码颗粒具有用作检测试剂，例如用于检测蛋白或肽的许多优点，如在免疫测定分析过程中。根据本发明的编码颗粒可以包含能够检测蛋白或肽，特别是蛋白的任何合适的一个或多个聚合物亚基。可检测试剂在各个方面，数字测定可以包含可检测试剂。可检测试剂可以包含发色团，如荧光或发光分子。在某些方面，可检测试剂可以与用于检测的靶分子关联。例如，可检测试剂可以与样品中存在的核酸分子(例如dna或rna)、肽、蛋白、脂质、代谢物、药物或其他分子(例如生物分子)关联。如本文所定义的，在可检测试剂的上下文中的“关联”包括经由共价和/或非共价相互作用与分子的相互作用。例如，可检测试剂可以通过与靶分子杂交而与靶分子关联。供选择地，可检测试剂可以例如是插层剂或发色团。在各个方面，可检测试剂可以包含荧光分子。在另外的方面，可检测试剂是发光的。在某些方面，可检测试剂可以是荧光素、荧光素的衍生物、若丹明、若丹明的衍生物、硼二吡咯甲川(bodipy)、bodipy的衍生物、半导体聚合物、半导体聚电解质、半导体聚合物点或发色团聚合物点。在一些情况下，发色团可以包含嵌入染料。所使用的可检测试剂可以取决于所采用的数字测定的类型。一方面，可通过非序列特异性荧光团，例如evagreen或sybrgreen产生可检测信号或代码，其中该荧光团当在溶液中时被猝灭，但是可以插入到双链dna中，在该双链dna中其表现出亮得多的荧光。因此，例如，在pcr过程中生成的大量双链dna可以在解链曲线测定中产生可检测的荧光水平。因此，将分隔体积的样品的温度升高或维持在特定核苷酸对或序列的解链点或其以上导致双链dna分子完全或仅部分分离，从而释放嵌入染料。如此释放，在解链曲线测定中来自分隔体积的可检测信号或代码的强度会随着嵌入染料分散到分隔体积中而降低。另一方面，可以使用序列特异性荧光探针。一方面，这可以由分子信标，例如发夹结构组成，其荧光在其封闭构象中被高度猝灭，并且其一旦与靶分子或与和靶分子的存在相关的分子杂交，其强度就增加。另一方面，特异性荧光探针可以包含能够与猝灭剂杂交的探针，其中在包括结合区的延伸的扩增步骤过程中，能够与探针结合或杂交的猝灭剂的部分经历聚合酶介导的裂解。编码颗粒根据本发明，探针可以包含编码颗粒。编码颗粒可以用化学或物理上可区分的一个或多个特征进行编码。根据本发明的编码颗粒能够被检测和识别或产生特征性可检测信号或代码。在一些方面，编码颗粒包含具有两种或更多种可区分的性质的化合物。在某些方面，编码颗粒包含分子的聚集体，其中编码颗粒具有两种或更多种可区分的性质。编码颗粒可以包含发色团。在一些情况下，编码颗粒可以包含多个发色团。编码颗粒可以包含多个独特发色团。编码颗粒的发色团可以是发光的、荧光的或其组合。如本文所述，编码颗粒或其发色团可以包含无机材料、有机材料或其组合。例如，编码颗粒的发色团可以包含金属络合物。在一些情况下，编码颗粒或其发色团可以包含有机和无机材料的互穿网络。在一些情况下，编码颗粒或其发色团可以包含半导体纳米晶体，如量子点。在其他情况下，编码颗粒或其发色团可以包含半导体聚合物。在一些情况下，编码颗粒或其发色团可以包含聚合物点。在一些情况下，编码颗粒的发色团可以包含染料或小分子染料。在一些方面，编码颗粒包含具有两个或更多个染料单元、三个或更多个染料单元、四个或更多个染料单元或五个或更多个染料单元的延伸的分子。在一些方面，编码颗粒包含两个或更多个不同类型的可检测组分，例如，编码颗粒可以包含染料分子和非染料荧光团。在另外的方面，编码颗粒包含三种或更多种不同类型的可检测组分，例如，编码颗粒可以包含染料和两种另外的非染料荧光团。编码颗粒可以包含基质。编码颗粒的基质可以包含有机材料。例如，编码颗粒的基质可以包含一种或多种聚合物。在一些情况下，编码颗粒的基质可以包含一种或多种半导体聚合物。在一些情况下，编码颗粒的基质可以包含一种或多种非半导体聚合物或分子。例如，编码颗粒的基质可以包含聚苯乙烯(ps)或聚(甲基丙烯酸甲酯)(pmma)。在一些情况下，编码聚合物的基质可以包含发色团。例如，编码颗粒的基质可以包含发色团半导体聚合物，如聚合物点。在一些情况下，编码颗粒的基质可以包含多个发色团半导体聚合物(例如，相同类型或不同类型的多个聚合物链)。编码颗粒的基质还可以包含无机材料。在一些情况下，编码颗粒的基质可以包含以下一种或多种：二氧化硅、硅酸盐、二氧化钛、磷酸盐或其组合。在一些情况下，编码颗粒的基质可以包含无机和有机材料的组合(例如，有机-无机混合编码颗粒)。在一些方面，编码颗粒可以是纳米颗粒。编码颗粒的形状可以大致为球形。颗粒尺寸的量度可以用颗粒的最小尺寸表示，也称为颗粒的“临界尺寸”。例如，如果编码颗粒由纳米球组成，则编码颗粒的临界尺寸可以是颗粒的直径。一些编码颗粒，例如球体和立方体，就每个尺寸而言都可以是纳米级的。一些编码颗粒的某些尺寸是纳米级的，而其他尺寸大于纳米级。例如，纳米圆柱体可以具有纳米级直径，但是长度在微米级(例如，长度大于1000纳米的纳米圆柱体)。在一些情况下，编码颗粒可以包含另外的结构(例如，核酸)或可以与另外的结构关联(例如，纳米颗粒的核酸或聚合物链可以与核酸引物关联，而核酸引物进而可以连接到猝灭剂)，其中另外的一个或多个结构不在纳米级，但是编码颗粒保持纳米级的直径。探针或编码颗粒的临界尺寸(例如，编码颗粒的直径)可以为3纳米至1000纳米、1纳米至500纳米、1纳米至400纳米、1纳米至300纳米、1纳米至200纳米、1纳米至100纳米、1纳米至50纳米、1纳米至40纳米、1纳米至30纳米、1纳米至20纳米、1纳米至10纳米、10纳米至500纳米、50纳米至400纳米、100纳米至300纳米、约25纳米至约250纳米、约50纳米至约100纳米、约10纳米至约50纳米、约10纳米至约30纳米、约10纳米至约20纳米或约5纳米至约15纳米。在一些情况下，探针或编码颗粒的临界尺寸可以是流体动力学直径。编码颗粒可以具有至少一个大于3纳米的尺寸。编码颗粒还可以具有至少一个大于4纳米、5纳米、10纳米、15纳米、20纳米、25纳米、30纳米、35纳米、40纳米、45纳米或50纳米的尺寸。例如，编码颗粒可以包含发色团纳米颗粒，如聚合物点。在其他方面，编码颗粒可以具有至少一个小于4nm的尺寸或至少一个小于3纳米的尺寸。在某些方面，编码颗粒具有至少一个小于3nm的尺寸和至少一个大于3纳米、4纳米、5纳米、10纳米、15纳米、20纳米、25纳米、30纳米、35纳米、40纳米、45纳米或50纳米的尺寸。在一些方面，编码颗粒具有至少一个小于3纳米的尺寸和至少一个大于3纳米的尺寸。在一些情况下，编码颗粒的尺寸会影响编码颗粒的功能。例如，编码颗粒的尺寸可以影响纳米颗粒的发射强度或编码颗粒的发射光谱。在一些情况下，发色团聚合物编码颗粒的聚集可以导致编码颗粒的发射强度降低或编码颗粒的发射光谱改变。本发明的编码颗粒可以具有各种形式或形状。例如，编码颗粒的形状可以是球体、圆柱体、椭球体、多面体、棱柱、棒、立方体、薄片、棱锥或线。纳米颗粒的形状可以有助于纳米颗粒的功能。例如，纳米颗粒的形状可以有助于纳米颗粒的光学性质(例如，纳米棒可以具有与纳米球不同的光学性质)。编码颗粒可以包含多种材料，包括可检测试剂和其他材料。例如，编码颗粒可以包含塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、金属、顺磁性材料、氧化钍溶胶、石墨碳、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖，如琼脂糖、纤维素、尼龙、交联胶束和聚四氟乙烯。编码颗粒的发色团聚合物组成各种类型的发色团聚合物颗粒适合用作本发明的光学编码和/或生物分子编码方法的平台。应当理解，本文中涉及发色团聚合物颗粒的任何描述均适用于本发明的编码颗粒。编码颗粒可以采用多种构型，包括但不限于具有均匀、均质组成的整体聚合物颗粒或具有独特的芯和帽结构的聚合物颗粒。本文提供的编码颗粒可以通过本领域已知的任何方法形成，包括但不限于依赖于沉淀的方法、依赖于乳液(例如，细乳液或微乳液)形成的方法以及依赖于缩合的方法。适合用于本文所述技术的另外的编码颗粒组成的实例(例如，发色团聚合物颗粒组成)可以见于例如第pct/us2010/056079号、第pct/us2012/071767号、第pct/us2011/056768号、第pct/us2013/024300号、第pct/us2013/063917号和第pct/us2014/067471号pct申请，以及第13/687,813号美国专利申请，其各自通过引用并入本文。任何合适数量和组合的发色团聚合物类型可以掺入本文所述的编码颗粒中，例如一种或更多种发色团聚合物、两种或更多种发色团聚合物、三种或更多种发色团聚合物、四种或更多种发色团聚合物、五种或更多种发色团聚合物、六种或更多种发色团聚合物、七种或更多种发色团聚合物、八种或更多种发色团聚合物、九种或更多种发色团聚合物、十种或更多种发色团聚合物、五十种或更多种发色团聚合物或一百种或更多种发色团聚合物。相对于整个编码颗粒质量，发色团聚合物的质量浓度可以在1％至100％之间，更优选10％至99％之间，更优选20％至99％之间，更优选30％至99％之间，更优选40％至99％之间，以及更优选50％至99％之间变化。在一些方面，本文所述的编码颗粒包含由一种或多种发色团聚合物形成的聚合物基质。发色团聚合物可以是均聚物或杂聚物。在各个方面，发色团聚合物可以是半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。例如，许多半导体聚合物适合用于根据本发明的编码颗粒。已经开发出具有从紫外到红外的发射波长范围，包括整个可见光谱的半导体聚合物。半导体聚合物的实例包括但不限于：聚芴聚合物，包括但不限于基于聚(9,9-二己基芴基-2,7-二基)(pdhf)的聚合物和基于聚(9,9-二辛基)芴基-2,7-二基)(pfo)的聚合物；基于芴的共聚物，包括但不限于，聚[{9,9-二辛基)-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-交替共聚-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-l,4-亚苯基}](pfpv)、聚[(9,9-二辛基)芴基-2,7-二基)-共聚-(l,4-苯并-{2,l,3}-噻二唑)](pfbt)、聚[(9,9-二辛基)芴基-2,7-二基)-共聚-(4,7-二-2-噻吩基-2,1,3-苯并噻二唑)](pftbt)和聚[(9,9-二辛基)芴基-2,7-二基)-共聚-(4,7-二-2-噻吩基-2,l,3-苯并噻二唑)](pf-0.1tbt)；基于亚苯基亚乙烯基的聚合物，包括但不限于，聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基亚乙烯基](meh-ppv)和聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)](cn-ppv)；亚苯基亚乙炔基聚合物，包括但不限于，聚(2,5-二(3’,7’-二甲基辛基)亚苯基-1,4-亚乙炔基(ppe)；基于bodipy(硼二吡咯甲川)的聚合物；基于方酸菁的聚合物；基于pvk(聚乙烯基咔唑)的聚合物；或其组合。多种发色团聚合物结构适合用于根据本发明的各个方面。在一些方面，发色团聚合物可以是线性聚合物。在其他方面，发色团聚合物可以是支链聚合物。在某些方面，发色团聚合物可以是树枝状聚合物。在某些方面，发色团聚合物可以是刷状聚合物。在某些方面，发色团聚合物可以是星形聚合物。在一些方面，可以使用包含基于聚苯乙烯的梳状聚合物的编码颗粒。基于聚苯乙烯的梳状聚合物的非限制性实例包括聚苯乙烯接枝丙烯酸、聚苯乙烯接枝环氧乙烷、聚苯乙烯接枝丁醇等。在一些方面，可以使用包含基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的编码颗粒。基于聚(甲基丙烯酸甲酯)的梳状聚合物的非限制性实例包括聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝丙烯酸、聚(甲基丙烯酸甲酯)接枝环氧乙烷等。在一些方面，可以使用包含梳状聚合物的编码颗粒，所述梳状聚合物包含羧基、氨基、巯基、酯基、琥珀酰亚胺酯基、叠氮基、炔基、环辛炔基或膦基。在一些方面，可以使用编码颗粒，其在末端单体单元上包含官能化的聚合物，例如具有羧基、氨基、巯基、酯基、琥珀酰亚胺酯基、叠氮基、炔基、环辛炔基或膦基或类似的官能团的聚合物。可以使用的聚合物的实例包括但不限于聚(甲基)丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、聚异丁烯、聚二烯、聚亚苯基、聚乙烯、聚(乙二醇)、聚丙交酯、聚苯乙烯、聚硅氧烷、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚氨酯、其嵌段共聚物、其无规或交替共聚物等。在一些方面，可以使用包含具有一种或多种官能化单体单元的共聚物的编码颗粒，所述共聚物例如两亲聚合物，包括但不限于：基于聚((甲基)丙烯酸)的共聚物，例如：聚(丙烯酸-b-丙烯酰胺)、聚(丙烯酸-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(n-丙烯酸丁酯-b-丙烯酸)、聚(丙烯酸钠-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸-b-甲基丙烯酸新戊酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-n,n-二甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸甲酯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(甲基丙烯酸新戊酯-b-甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯-b-环氧乙烷)、聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸-b-丙烯酸)；基于聚二烯共聚物，例如：聚(丁二烯(1,2加成)-b-环氧乙烷)、聚(丁二烯(1,2加成)-b-甲基丙烯酸、聚(丁二烯(1,4加成)-b-丙烯酸)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-环氧乙烷、聚(丁二烯(1,4加成)-b-丙烯酸钠)、聚(丁二烯(1,4加成)-b-n-甲基4-乙烯基碘化吡啶)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)、聚(异戊二烯-b-环氧乙烷)和聚(异戊二烯-b-n-甲基2-乙烯基碘化吡啶)；基于聚(环氧乙烷)的共聚物，例如：聚(环氧乙烷-b-丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-环氧丁烷)、聚(环氧乙烷-b-c-己内酯)、聚(环氧乙烷-b-丙交酯)、聚(环氧乙烷-b-丙交酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸硝基苄酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸n,n-二甲基氨基乙酯)、聚(环氧乙烷-b-环氧丙烷)、聚(环氧乙烷-b-丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(环氧乙烷-b-甲基丙烯酸四氢糠酯)、聚(环氧乙烷-b-2-乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(环氧乙烷-b-2-甲基噁唑啉)；基于聚异丁烯的共聚物，如聚(异丁烯-b-丙烯酸)、聚(异丁烯-b-环氧乙烷)、聚(异丁烯-b-甲基丙烯酸)；基于聚苯乙烯的共聚物，如聚(苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸铯)、聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、在嵌段连接处酸可裂解的聚(苯乙烯-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸)、聚(4-苯乙烯磺酸-b-环氧乙烷)、聚(苯乙烯磺酸-b-甲基丁烯)、聚(苯乙烯-b-n,n-二甲基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-n-异丙基丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-b-n-甲基2-乙烯基碘化吡啶)、聚(苯乙烯-b-n-甲基-4-乙烯基碘化吡啶)、聚(苯乙烯-b-丙基丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-丙烯酸钠)聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸钠)、聚(对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共聚-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酰胺)、聚(苯乙烯-共聚-对氯甲基苯乙烯-b-丙烯酸)、聚(苯乙烯-b-甲基丁烯-共聚-异戊二烯磺酸酯)；基于聚硅氧烷的共聚物，例如聚(二甲基硅氧烷-b-丙烯酸)、聚(二甲基硅氧烷-b-环氧乙烷)、聚(二甲基硅氧烷-b-甲基丙烯酸)；基于聚(二茂铁基二甲基硅烷)的共聚物，例如聚(二茂铁基二甲基硅烷-b-环氧乙烷)；基于聚(2-乙烯基萘)共聚物，例如聚(2-乙烯基萘-b-丙烯酸)、基于聚(乙烯基吡啶和n-甲基乙烯基碘化吡啶)的共聚物，例如聚(2-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)、聚(2-乙烯基吡啶-b-甲基丙烯酸)、聚(n-甲基2-乙烯基碘化吡啶-b-环氧乙烷)、聚(n-甲基4-乙烯基碘化吡啶-b-甲基丙烯酸甲酯)、聚(4-乙烯基吡啶-b-环氧乙烷)peo末端官能oh；和基于聚(乙烯吡咯烷酮)共聚物，例如聚(乙烯吡咯烷酮-b-d/l-丙交酯)；等等。在一些方面，用于检测核酸、蛋白或肽的编码颗粒可以包括具有至少两个不同的发色团单元的半导体共聚物。例如，缀合的共聚物可以包含以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色团单元。用于合成半导体共聚物的典型发色团单元包括但不限于芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、乙烯基咔唑单元、硼二吡咯甲川单元、方酸菁单元、包含镧系元素的单元，及其衍生物。不同的发色团单元可以是隔开的，例如在嵌段共聚物中，或者是掺杂的。在一些方面，发色团共聚物通过书写主要发色团物质的身份来表示。例如，pfbt是包含特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色团聚合物。在一些情况下，破折号用于表示次要发色团物质的百分比，此后表示次要发色团物质的身份。例如，pf-0.1bt是包含90％pf和10％bt的发色团共聚物。在某些方面，编码颗粒可以包含半导体聚合物的共混物。共混物可包括均聚物、共聚物和低聚物的任何组合。可以选择用于形成编码颗粒的聚合物共混物，以调节得到的聚合物颗粒的性质，例如以实现聚合物颗粒的期望激发或发射光谱。对于一些测定，半导体编码颗粒提供了改善的检测灵敏度，部分原因是它们显示出比其他荧光报告分子更高的量子产率。在一些方面，使用的发色团聚合物颗粒的量子产率大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。对于一些测定，半导体编码颗粒提供了改善的检测灵敏度，部分原因是它们显示出比其他荧光报告分子更快的反射速率。在某些方面，使用的编码颗粒的发射速率为约100皮秒至约50纳秒。在一些方面，使用的编码颗粒包含带有小有机染料分子、金属络合物、光致变色染料及其任意组合的单元的聚合物，例如，与小有机染料、金属络合物、光致变色染料及其任何组合共价连接或接枝的光学惰性聚合物，例如聚苯乙烯。这些染料或金属络合物可以具有蛋白感测能力。在一些方面，编码颗粒包含作为发射单元的与小有机染料分子、金属络合物、光致变色染料及其任意组合共价连接的半导体聚合物。这样的发射单元可以调节发射颜色、增加量子产率并改善发色团聚合物颗粒的光稳定性。在一些方面，小有机染料或金属络合物可以具有感测功能，因此为编码颗粒增加了额外功能，例如蛋白感测能力。在一些方面，编码颗粒可以包含与其他发色团聚合物物理混合或化学交联的半导体聚合物，例如与小有机染料、金属络合物、光致变色染料及其任意组合共价连接或接枝的光学惰性聚合物，以具有额外功能，例如感测。在一些方面，发色团聚合物颗粒可以包含与其他组分，例如荧光染料、无机发光材料、磁性材料、金属材料等物理混合或化学交联的半导体聚合物，以调节发射颜色，改善量子产率和/或光稳定性，和/或提供额外功能，例如磁功能、等离子共振功能等。给定的发色团聚合物颗粒的光学性质，例如吸收波长，可以通过改变其组成和几何形状来调节。已经开发了具有从紫外到红外范围的吸收波长，包括整个可见光谱的半导体聚合物。在一些方面，使用峰值吸收波长为约200纳米至约300纳米、约250纳米至约350纳米、约300纳米至约400纳米、约350纳米至约450纳米、约400纳米至约500纳米、约450纳米至约550纳米、约500纳米至约600纳米、约550纳米至约650纳米、约600纳米至约700纳米、约650纳米至约750纳米、约700纳米至约800纳米、约750纳米至约850纳米、约800纳米至约900纳米、约850纳米至约950纳米或约900纳米至约1000纳米的编码颗粒。已经开发了具有从紫外到红外范围，包括整个可见光谱的发射波长的半导体聚合物。在一些方面，使用峰值发射波长为约200纳米至约300纳米、约250纳米至约350纳米、约300纳米至约400纳米、约350纳米至约450纳米、约400纳米至约500纳米、约450纳米至约550纳米、约500纳米至约600纳米、约550纳米至约650纳米、约600纳米至约700纳米、约650纳米至约750纳米、约700纳米至约800纳米、约750纳米至约850纳米、约800纳米至约900纳米、约850纳米至约950纳米、约900纳米至约1000纳米、约950纳米至约1050纳米、约1000纳米至约1100纳米、约1150纳米至约1250纳米或约1200纳米至约1300纳米的编码颗粒。在一些方面，本发明提供了具有窄带发射的编码颗粒。窄带发射对于某些应用是有利的，包括但不限于多路复用应用。聚合物颗粒的发射波长可以从紫外到近红外区变化。在一些方面，发射带的半高全宽(fwhm)小于70纳米。在一些方面，fwhm小于约65纳米。在一些方面，fwhm小于约60纳米。在一些方面，fwhm小于约55纳米。在一些方面，fwhm小于约50纳米。在一些方面，fwhm小于约45纳米。在一些方面，fwhm小于约40纳米。在一些方面，fwhm小于约35纳米。在一些方面，fwhm小于约30纳米。在一些方面，fwhm小于约25纳米。在一些方面，fwhm小于约20纳米。在一些方面，fwhm小于约10纳米。在一些方面，本文所述的聚合物颗粒的fwhm范围可以为约5纳米至约70纳米、约10纳米至约60纳米、约20纳米至约50纳米或约30纳米至约45纳米。多种发色团聚合物颗粒可用于编码，例如本文所述的实例以及例如在pct/us2010/056079和pct/us2012/071767中公开的其他实例，将其中每一篇的全部内容通过引用并入本文，并且具体涉及特定的发色团聚合物颗粒组成及其各自的制备方法，如其中所述。如例如在pct/us2010/056079中提供的，发色团聚合物颗粒中的聚合物可以物理共混或化学键合(或化学交联)。例如，物理共混的聚合物颗粒可以包括在发色团聚合物颗粒中共混并通过非共价相互作用保持在一起的聚合物。化学键合的发色团聚合物颗粒可以包括在聚合物颗粒中彼此共价连接的聚合物。化学键合的聚合物可以在形成聚合物颗粒之前彼此共价连接。有机-无机编码颗粒编码颗粒可以包含有机材料或无机材料或其组合。例如，编码颗粒可以包含有机-无机混合物。在一些情况下，编码颗粒可以包含有机和无机材料的互穿网络。本发明提供了有机-无机混合编码颗粒的各种实施方案，其在本文中也称为“混合编码颗粒”。在一些情况下，混合编码颗粒可以是聚合物点(例如，混合聚合物点)。在一些实施方案中，有机-无机混合编码颗粒可包含有机网络和无机网络。在某些实施方案中，有机网络包括至少一种有机物质，例如本文所述的发色团聚合物中的一种或多种。在一些情况下，无机网络可包含至少一种无机物质，例如硅氧烷、铝硅氧烷、钛硅氧烷、氧化钛或其组合。在某些实施方案中，无机网络可以是硅氧烷网络(例如，包括si-o-si键)、铝硅氧烷网络(例如，包括al-o-si键)、钛硅氧烷网络(例如，包括ti-o-si键)、氧化钛网络(例如，包括ti-o-ti键)或其组合。术语“硅氧烷网络”和“二氧化硅(sio2)网络”在本文同义处理。可以用于本文描述的方法、组合物和系统的二氧化硅和混合编码颗粒(例如，混合聚合物点)的另外的实例可以见于pct/us2017/037260，将其全部内容引入本文。在一些实施方案中，有机网络和无机网络彼此互穿，从而形成有机-无机互穿网络。例如，硅氧烷网络可以与发色团聚合物形成互穿网络。如本文所用的，“有机-无机互穿网络”是指包含至少两个一起形成互穿网络的网络的编码颗粒。在一些情况下，有机-无机互穿网络可以是无机网络与聚合物互穿的网状和/或互锁结构。在一些情况下，互穿可以主要通过至少两个网络的物理关联(例如疏水相互作用)发生，从而形成互穿网络。在某些情况下，互穿可以通过至少两个网络的物理关联而发生，而没有任何化学键合(例如，两个网络之间没有共价键合)。在某些情况下，互穿可以主要通过两个网络彼此的化学键合(例如，共价键合)发生，从而形成互穿网络。有机网络和无机网络之间的共价键合可以替代物理关联或与物理关联组合使用，以形成有机-无机互穿网络。在某些实施方案中，本发明提供了结构上可以与其他类型的编码颗粒和聚合物点不同的有机-无机混合编码颗粒(例如，混合聚合物点)，包括但不限于通过共混形成的编码颗粒(例如，与两亲聚合物共混的编码颗粒)和没有无机网络的编码颗粒。例如，在一些实施方案中，本文所述的混合编码颗粒的有机-无机互穿网络不同于在其他类型的编码颗粒中可以存在的芯-帽或芯-壳结构。在某些实施方案中，本文的有机-无机混合编码颗粒不包括芯-帽或芯-壳结构。如本文进一步详细描述的，在一些实施方案中，可以在形成有机-无机混合编码颗粒的过程中形成有机-无机互穿网络。例如，在一些实施方案中，有机-无机混合编码颗粒的形成涉及在有机硅烷分子的水解过程中形成硅氧烷网络。在一些情况下，一种或多种聚合物可以在有机硅烷分子水解和交联的同时塌陷、沉淀或缩合，以同时形成有机网络和无机网络，所述有机网络和无机网络一起形成有机-无机互穿网络。本发明的混合编码颗粒可以被官能化和/或生物缀合，例如生物缀合到生物分子。在一些实施方案中，混合编码颗粒包含有机网络(例如，半导体发色团聚合物)、无机网络(例如，硅氧烷网络)和x，其中x是适合于生物缀合的官能团。下文进一步提供根据本发明的适合用于生物缀合的官能团和/或接头的实例。官能团x可以连接到无机网络、有机网络或其组合。在一些实施方案中，混合编码颗粒包含至少两个正交反应性化学基团。在某些实施方案中，正交反应性化学基团是仅与其指定的化学反应性基团反应，而不与可能存在的另外的化学反应性基团反应的化学基团。例如，反应性基团a和b可以形成彼此反应的指定的一对，反应性基团y和z可以形成彼此反应的指定的另一对。在这样的实施方案中，因为a不与z反应，所以反应性基团a被认为相对于y正交，并且因为y不与b反应，所以反应性基团y相对于a正交。在一些实施方案中，反应性基团a可以彼此反应或与反应性基团b反应以形成硅氧烷网络，反应性基团y不与a或b反应，使得a和y和/或b和y被认为是正交反应性基团。具有硅氧烷网络的有机-无机混合编码颗粒如本文所述，编码颗粒可以包含硅氧烷网络，例如包括多个si-o-si键的网络。硅氧烷网络可以通过一种或多种硅烷和/或硅氧烷物质的全部或部分水解来形成。编码颗粒中硅氧烷网络和/或其组分(例如硅)的重量百分比可以根据需要变化。在一些实施方案中，选择硅氧烷网络和/或其组分(例如硅)的重量百分比以避免在得到的混合编码颗粒中形成芯-壳结构。在某些实施方案中，来自混合编码颗粒中的硅氧烷网络的硅的重量百分比小于或等于约1％、小于或等于约5％、小于或等于约10％、小于或等于约15％、小于或等于约20％、小于或等于约25％、小于或等于约30％、小于或等于约35％、小于或等于约40％、小于或等于约45％或小于或等于约47％。在某些实施方案中，来自混合编码颗粒中的硅氧烷网络的硅的重量百分比大于或等于约1％、大于或等于约5％、大于或等于约10％、大于或等于约15％、大于或等于约20％、大于或等于约25％、大于或等于约30％、大于或等于约35％、大于或等于约40％或大于或等于约45％。在某些实施方案中，来自混合编码颗粒中的硅氧烷网络的硅的重量百分比在约1％至约45％的范围内或在约1％至约47％的范围内。有机-无机混合编码颗粒可以包含至少两种硅烷物质，所述每种硅烷物质具有其自己各自的功能。混合编码颗粒可以包含硅氧烷网络和至少一个其他网络，以形成互穿的有机-无机网络。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含半导体发色团聚合物和硅氧烷网络的有机-无机混合编码颗粒，其中所述半导体发色团聚合物和硅氧烷网络形成有机-无机互穿网络。互穿网络可以是与发色团聚合物互穿的硅氧烷网络的网状和/或互锁结构(例如，不形成芯-帽或芯-壳结构)。可以以各种方式形成具有硅氧烷网络的有机-无机混合编码颗粒。在某些实施方案中，混合编码颗粒是通过硅氧烷网络与发色团聚合物的物理关联形成的，从而形成互穿网络。供选择地或组合地，硅氧烷网络和发色团聚合物可以彼此化学键合(例如，共价键合)以形成互穿网络。具有在硅氧烷网络和半导体发色团聚合物之间的物理关联的混合编码颗粒在一些实施方案中，本发明提供了混合编码颗粒，其中硅氧烷网络与半导体发色团聚合物物理关联，例如通过疏水相互作用物理关联。在一些实施方案中，硅氧烷网络包含亚烷基、烷氧基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、烷基胺基、环烷基、亚环烷基、杂环烷基或亚杂环烷基。在一些实施方案中，硅氧烷网络包括一个或多个正交交联单元。在某些实施方案中，正交交联单元包括仅与其指定的反应性基团交联，而不与也可能存在的另外的反应性基团交联的反应性基团。在一些实施方案中，硅氧烷网络可以包含多个互连单元。在一些实施方案中，发色团聚合物与硅氧烷网络物理关联但不共价键合。例如，在各种实施方案中，发色团聚合物没有被硅烷官能化，并且混合编码颗粒的互穿网络的官能化和形成仅通过发色团聚合物与硅氧烷网络的物理关联(例如疏水相互作用)来实现。在供选择的实施方案中，发色团聚合物也可以与硅氧烷网络共价键合，如本文下文更详细讨论的。用于混合编码颗粒的发色团聚合物本文所述的编码颗粒可以包含各种类型的发色团聚合物，如本文所述的一种或多种发色团聚合物。编码颗粒可以包括一种或多种已塌缩成稳定的亚微米级颗粒的发色团聚合物(例如，半导体发色团聚合物)。在一些实施方案中，本发明的混合编码颗粒包含多种聚合物。例如，混合编码颗粒可以包含发色团聚合物的共混物。在某些实施方案中，混合编码颗粒包含半导体发色团聚合物的共混物。共混物可包括均聚物、共聚物和低聚物的任何组合。可以选择用于形成混合编码颗粒的聚合物共混物，以调节得到的聚合物颗粒的性质，例如，以实现混合编码颗粒的期望的激发或发射光谱。混合编码颗粒可以包含具有一个或多个重复单元的聚合物，所述重复单元可以以固定、有序或无规构型和比例组合。重复单元可以是在整个聚合物中出现的单体或化学基序，例如芳族或杂环单元。聚合物可以被卤化，例如，氟化、氯化、溴化或碘化。聚合物、重复单元或单体可以在一个或多个位点被卤化。与非卤代的类似聚合物相比，卤代聚合物，例如氟化聚合物，可以提供更高水平的荧光。任何合适数量和组合的发色团聚合物类型可以掺入本文所述的混合编码颗粒中，例如一种或多种发色团聚合物、两种或更多种发色团聚合物、三种或更多种发色团聚合物、四种或更多种发色团聚合物、五种或更多种发色团聚合物、六种或更多种发色团聚合物、七种或更多种发色团聚合物、八种或更多种发色团聚合物，九种或更多种发色团聚合物，十种或更多种发色团聚合物，五十种或更多种发色团聚合物或一百种或更多种发色团聚合物。发色团聚合物可以是均聚物或杂聚物。在各种实施方案中，发色团聚合物可以是半导体聚合物、非半导体聚合物或其组合。例如，许多半导体聚合物适合用于根据本发明的混合编码颗粒。已经开发出具有从紫外到红外范围的发射波长，包括整个可见光谱的半导体聚合物。多种发色团聚合物结构适合根据各种实施方案和本发明的实施方案的用途。在一些实施方案中，发色团聚合物是线性聚合物。在其他实施方案中，发色团聚合物是支链聚合物。在某些实施方案中，发色团聚合物是树枝状聚合物。在某些实施方案中，发色团聚合物是刷状聚合物。在某些实施方案中，发色团聚合物是星形聚合物。在一些实施方案中，发色团聚合物包含在末端单体单元上官能化的聚合物，例如具有羧基、胺基、巯基、酯基、琥珀酰亚胺酯基、叠氮基、炔基、环辛炔基或膦基或类似的官能团的聚合物。在本发明的一些实施方案中，本文提供的混合编码颗粒包含聚合物cn-ppv，也称为聚[2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-(1-氰基亚乙烯基-1,4-亚苯基)]，它是一种明亮、致密且发射橙光的半导体聚合物颗粒。在某些实施方案中，cn-ppv具有优异的荧光性质，例如大吸收截面、高量子产率和快发射速率。在一些实施方案中，混合编码颗粒包含基本上由cn-ppv组成的聚合物。在一些实施方案中，颗粒包括cn-ppv和至少一种其他材料。例如，cn-ppv可以形成共聚物的部分或与提供额外功能的共聚物或其他材料混合。在一些实施方案中，本发明的混合编码颗粒包含具有至少两个不同的发色团单元的半导体共聚物。例如，缀合的或半导体共聚物可以包含以给定比例存在的芴和苯并噻唑发色团单元。用于合成半导体共聚物的典型发色团单元包括但不限于芴单元、亚苯基亚乙烯基单元、亚苯基单元、亚苯基亚乙炔基单元、苯并噻唑单元、噻吩单元、咔唑芴单元、乙烯基咔唑单元、硼二吡咯甲川单元、方酸菁单元、包含镧系元素的单元，及其衍生物。不同的发色团单元可以是隔开的，例如在嵌段共聚物中，或者是掺杂的。在一些实施方案中，发色团共聚物通过书写主要发色团物质的身份来表示。例如，pfbt是包含特定比例的芴和苯并噻唑单元的发色团聚合物。在一些实施方案中，破折号用于表示次要发色团物质的百分比，此后表示次要发色团物质的身份。例如，pf-0.1bt是包含90％pf和10％bt的发色团共聚物。编码颗粒的镧系元素组成在本发明的一些方面，本文所述的编码颗粒包含一种或多种镧系元素材料。镧系元素材料可以是镧系元素离子、镧系元素络合物或镧系元素纳米颗粒。在某些方面，镧系元素材料是镧系元素发色团。在一些方面，本发明利用镧系元素离子的独特发光性质，例如其窄发射带宽、长寿命以及不容易受到环境影响的稳定的f-f跃迁。因此，当整合到缀合的聚合物纳米颗粒或其他类型的发色团聚合物颗粒中时，镧系元素离子保持其独特的发光，并且其发射强度可以独立或半独立地调整。基于这些独特的性质，本发明提供了用于高通量生物分析的改进的编码技术。在某些方面，与有机荧光团相比，本文所述的镧系元素发色团具有窄发射性质、长发光寿命和独特的发光机制。例如，在其4f壳层不为空并且没有被电子完全填充的镧系元素(iii)离子(例如ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、eu(iii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)或yb(iii))的原理性发光机制中，f壳层内的跃迁可以产生从紫外区到近红外区范围的发光。在一些方面，因为内壳层f轨道电子被填充的5s5p子壳层与环境隔离，所以它们的发光不随环境变化很大。在一些方面，镧系元素离子表现出斯托克斯发光，即短波长光子激发产生长波长光子发射。在某些方面，一个光子激发可以产生两个或更多个光子发射(量子切割)，例如，一个光子的能量可以被分裂为具有两个或更多个光子发射。在一些方面，镧系元素离子表现出反斯托克斯发光(上转换发光)，例如，两个或更多个长波长光子激发产生短波长光子发射。各种类型的镧系元素发色团适合用于本发明。镧系元素发色团可包括任何合适类型的镧系元素材料，例如镧系元素离子、镧系元素络合物、镧系元素纳米颗粒或其组合。在一些方面，镧系元素发色团包括选自la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、sm(ii)、eu(iii)、eu(ii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)、yb(ii)、lu(iii)或其组合的镧系元素。在一些方面，本发明的镧系元素发色团是镧系元素衍生物，例如选自烷基衍生物、芳基衍生物、炔烃衍生物、芳族衍生物、醇盐衍生物、氮杂衍生物、其扩展系统或其类似物的镧系元素衍生物。在某些方面，将镧系元素发色团掺杂在无机主体材料中，例如镧系元素氧化物、镧系元素氟化物和相关材料。镧系元素离子还可与有机发色团配位以形成镧系元素发色团络合物。在一些方面，镧系元素发色团包括选自sc、y、la、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu的稀土金属或其组合。在某些方面，镧系元素发色团包括用作不发光主体材料的稀土金属(例如，稀土金属离子)(例如，sc、y、la、gd、lu或其组合)和掺杂在主体中的一种或多种发光稀土金属离子(例如eu(iii)、tb(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)或其组合)。在各个方面，镧系元素发色团包括至少一种优选用于下转换发光的掺杂的镧系元素离子，例如pr(iii)、sm(iii)、eu(iii)、tb(iii)、dy(iii)、yb(iii)或其组合。在各个方面，镧系元素发色团包括至少一种优选用于上转换发光的掺杂的镧系元素离子，例ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)或其组合。可以将任何合适数量和组合的离子同时掺杂到单一主体材料中，例如两种或更多种离子、三种或更多种离子、四种或更多种离子、五种或更多种离子、六种或更多种离子、七种或更多种离子、八种或更多种离子、九种或更多种离子或十种或更多种离子。在某些方面，本发明的编码颗粒可以包含至少一种类型的如本文所述的发色团聚合物和至少一种类型的镧系元素发色团，例如镧系元素离子、镧系元素络合物或镧系元素纳米颗粒。发色团聚合物和/或镧系元素发色团的光学性质可以根据需要变化。在一些方面，发色团聚合物是荧光的，使得聚合物荧光和镧系元素发色团发光都可以用于编码。在一些方面，发色团聚合物是弱荧光的或显著猝灭的，使得仅镧系元素材料用于编码。在某些方面，镧系元素发色团的峰值发射波长比发色团聚合物的峰值发射波长更长。在其他方面，镧系元素发色团的峰值发射波长比发色团聚合物的峰值发射波长更短。在一些方面，编码颗粒提供了可以容纳镧系元素材料的柔性聚合物基质(例如，由一种或多种发色团聚合物形成)。因此，在某些方面，编码颗粒包含聚合物基质和掺入聚合物基质中的至少一种镧系元素发色团。可以将任何合适数量和组合的镧系元素发色团类型掺入聚合物基质中，例如一种或更多种镧系元素发色团、两种或更多种镧系元素发色团、三种或更多种镧系元素发色团、四种或更多种镧系元素发色团、五种或更多种镧系元素发色团、六种或更多种镧系元素发色团、七种或更多种镧系元素发色团、八种或更多种镧系元素发色团、九种或更多种镧系元素发色团、十种或更多种镧系元素发色团、五十种或更多种镧系元素发色团或一百种或更多种镧系元素发色团。镧系元素材料相对于整个编码颗粒质量的质量浓度可以在1％至99％，更优选10％至99％，更优选20％至99％，更优选30％至99％，更优选40％至99％，且更优选50％至99％之间变化。在某些方面，至少一些镧系元素发色团是独特的镧系元素发色团(例如，具有不同的结构、组成和/或性质)。例如，镧系元素发色团中的一些或全部可以具有彼此可区分的光学性质(例如，发射光谱、发射波长、发射强度、发射寿命)。编码颗粒中的镧系元素发色团的浓度可以根据需要变化。在一些方面，编码颗粒包含第一浓度的第一镧系元素发色团和第二浓度的第二镧系元素发色团。在某些方面，编码颗粒包含彼此为固定比例(例如，固定质量比)的两种或更多种镧系元素发色团。在各个方面，将聚合物基质和掺入聚合物基质中的一种或多种镧系元素发色团的光学性质设计成产生发色团聚合物颗粒的期望的光学编码。在一些方面，聚合物基质和一种或多种镧系元素发色团的光学性质(例如发射光谱)是彼此可区分的。例如，在某些方面，一种或多种镧系元素发色团的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更长的波长。在其他方面，一种或多种镧系元素发色团的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更短的波长。在各个方面，一种或多种镧系元素发色团和聚合物基质的发射峰的强度是可独立或半独立控制的。在某些方面，在聚合物基质与一种或多种镧系元素发色团之间存在能量转移。在供选择的方面，在聚合物基质与一种或多种镧系元素发色团之间基本上没有能量转移。在一些方面，掺入聚合物基质中的镧系元素发色团被物理嵌入或整合到聚合物基质中。在一些方面，镧系元素发色团与聚合物基质化学交联和/或物理共混。在一些方面，第一镧系元素发色团以第一浓度交联到聚合物基质，并且第二镧系元素发色团以不同于第一浓度的第二浓度交联到聚合物基质。在一些方面，将第一镧系元素发色团与聚合物基质在第一浓度下物理共混，并且将第二镧系元素发色团与聚合物基质在不同于第一浓度的第二浓度下物理共混。在一些方面，编码颗粒包含与镧系元素发色团物理共混、化学交联或共价结合的至少一种发色团聚合物，例如发光镧系元素络合物。示例性的发光镧系元素(iii)络合物包括la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、sm(ii)、eu(iii)、eu(ii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)、yb(ii)或lu(iii)络合物。因为大多数镧系元素络合物显示来自有机配体敏化的f-f跃迁的发光，所以可以通过改变聚合物和/或镧系元素络合物的结构和/或组成来控制从发色团聚合物到镧系元素络合物的能量转移。在一些方面，可以阻止或最小化从聚合物到镧系元素络合物的能量转移。在一些方面，可以允许从聚合物到镧系元素络合物的能量转移。颗粒的每组发射峰的光学性质(例如发射强度、发射波长、发射寿命)可以独立或半独立地调整和调节。在一些方面，编码颗粒包含与至少一种类型的发光镧系元素络合物，例如铽(tb)络合物物理共混或化学交联的一种类型的发色团聚合物。在一些方面，tb络合物通常显示亮绿色发光。可以通过改变聚合物和/或tb络合物的结构和/或组成来控制从发色团聚合物到tb络合物的能量转移。在一些方面，阻止或最小化从聚合物到tb络合物的能量转移。在一些方面，允许从聚合物到tb络合物的能量转移。因此，可以独立地或半独立地调整和调节颗粒内部的tb和发色团聚合物的光学性质(例如，发射强度、发射波长、发射寿命)。在一些方面，编码颗粒包含与至少一种类型的发光镧系元素络合物，例如铕(eu)络合物物理共混或化学交联的至少一种类型的发色团聚合物。在一些方面，eu络合物通常显示亮红色的发光。可以通过改变聚合物和/或eu络合物的结构和/或组成来控制从发色团聚合物到eu络合物的能量转移。在一些方面，阻止或最小化从聚合物到eu络合物的能量转移。在一些方面，允许从聚合物到eu络合物的能量转移。因此，可以独立地或半独立地调整和调节颗粒内部的eu和发色团聚合物的光学性质(例如，发射强度、发射波长、发射寿命)。在一些方面，编码颗粒包含与选自以下的镧系元素离子关联的至少一种类型的发色团聚合物：la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、sm(ii)、eu(iii)、eu(ii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)、yb(ii)或lu(iii)离子。镧系元素离子可以与发色团聚合物的主链、侧链或端基配位。因此，得到的编码颗粒包含发光离子。在一些方面，编码颗粒包含一种类型的镧系元素离子。在一些方面，编码颗粒包含两种类型的镧系元素离子。在一些方面，编码颗粒包含三种类型的镧系元素离子。在一些方面，编码颗粒包含四种类型的镧系元素离子。在一些方面，编码颗粒包含五种类型的镧系元素离子。在一些方面，编码颗粒包含大于六种类型的镧系元素离子。从发色团聚合物到镧系元素离子的能量转移可以通过改变聚合物和镧系元素离子的结构和组成来控制。在一些方面，阻止或最小化从聚合物到镧系元素离子的能量转移。在一些方面，允许从聚合物到镧系元素离子的能量转移。因此，可以独立地或半独立地调整和调节颗粒内部的每种物质的光学性质(例如，发射强度、发射波长、发射寿命)。在一些方面，发色团聚合物颗粒包含与至少一种类型的镧系元素纳米颗粒物理共混或化学交联的至少一种类型的发色团聚合物。在某些方面，镧系元素纳米颗粒是包含一个或多个镧系元素发色团的纳米颗粒。本发明的镧系元素纳米颗粒可以是掺杂镧系元素离子的无机纳米颗粒，例如氧化物、氟化物、硫化物、铝酸盐、硅酸盐、磷酸盐、钼酸盐、钛酸盐、铋酸盐、其他金属盐或其组合。在一些方面，镧系元素离子掺杂的无机纳米颗粒包含一种或多种金属盐。一方面，镧系元素纳米颗粒掺杂有一种类型的选自以下的镧系元素离子：la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、sm(ii)、eu(iii)、eu(ii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)、yb(ii)或lu(iii)离子。在一些方面，镧系元素纳米颗粒被两种或更多种类型的镧系元素离子共掺杂，因此得到的发色团聚合物颗粒包括两种或更多种类型的发光离子。掺杂的镧系元素离子可以是选自以下的任何组合：la(iii)、ce(iii)、pr(iii)、nd(iii)、pm(iii)、sm(iii)、sm(ii)、eu(iii)、eu(ii)、gd(iii)、tb(iii)、dy(iii)、ho(iii)、er(iii)、tm(iii)、yb(iii)、yb(ii)或lu(iii)离子。可以通过改变聚合物和镧系元素纳米颗粒的结构和/或组成来控制从发色团聚合物到镧系元素纳米颗粒的能量转移。在一些方面，可以防止或最小化从聚合物到镧系元素纳米颗粒的能量转移。在一些方面，可以允许从聚合物到镧系元素纳米颗粒的能量转移。因此，可以独立地或半独立地调整和调节颗粒内部的每种物质的光学性质(例如，发射强度、发射波长、发射寿命)。在一些方面，编码颗粒包含与至少一种类型的镧系元素上转换纳米颗粒物理共混或化学交联的至少一种类型的发色团聚合物。镧系元素上转换纳米颗粒描述了通过长波长多光子激发显示出短波长发光发射的纳米颗粒。镧系元素上转换纳米颗粒可以是掺杂镧系元素离子的无机纳米颗粒，例如氧化物、氟化物、硫化物、铝酸盐、硅酸盐、磷酸盐、钼酸盐、钛酸盐、铋酸盐、其他金属盐或其组合。用于编码颗粒的发色团染料组成在各个方面，本发明的编码颗粒包含一种或多种发色团染料，例如荧光染料、发光染料或其组合。发色团染料可以是小分子染料。在某些方面，本发明的编码颗粒可以包含至少一种类型的如本文所述的发色团聚合物和至少一种类型的发色团染料。发色团聚合物和/或发色团染料的光学性质可以根据需要变化。在一些方面，发色团聚合物是荧光的，使得聚合物荧光和发色染料发光两者均可用于编码。在一些方面，发色团聚合物是弱荧光的或显著猝灭的，使得仅镧系元素材料用于编码。在某些方面，发色团染料的峰值发射波长比发色团聚合物的峰值发射波长更长。在某些方面，发色团染料的峰值发射波长比发色团聚合物的峰值发射波长更短。在一些方面，编码颗粒提供了可以容纳发色团染料的柔性聚合物基质(例如，由一种或多种发色团聚合物形成)。因此，在某些方面，编码颗粒包含聚合物基质和掺入聚合物基质中的至少一种发色团染料。可以将任何合适数量和组合的发色团染料类型掺入聚合物基质中，例如一种或更多种发色团染料、两种或更多种发色团染料、三种或更多种发色团染料、四种或更多种发色团染料、五种或更多种发色团染料、六种或更多种发色团染料、七种或更多种发色团染料、八种或更多种发色团染料、九种或更多种发色团染料、十种或更多种发色团染料、五十种或更多种发色团染料或一百种或更多种发色团染料。发色团染料相对于整个编码颗粒质量的质量浓度可以在1％至99％，更优选10％至99％，更优选20％至99％，更优选30％至99％，更优选40％至99％，且更优选50％至99％之间变化。在某些方面，至少一些发色团染料是独特的发色团染料(例如，具有不同的结构、组成和/或性质)。例如，发色团染料中的一些或全部可以具有彼此可区分的光学性质(例如，发射光谱、发射波长、发射强度、发射寿命)。编码颗粒中的发色团染料的浓度可以根据需要变化。在一些方面，编码颗粒包含第一浓度的第一发色团染料和第二浓度的第二发色团染料。在某些方面，编码颗粒包含彼此为固定比例(例如，固定质量比)的两种或更多种发色团染料。在各个方面，将聚合物基质和掺入聚合物基质中的一种或多种发色团染料的光学性质设计成产生发色团聚合物颗粒的期望的光学编码。在一些方面，聚合物基质和一种或多种发色团染料的光学性质(例如发射光谱)是彼此可区分的。例如，在某些方面，一种或多种发色团染料的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更长的波长。在其他方面，一种或多种发色团染料的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更短的波长。在各个方面，一种或多种发色团染料和聚合物基质的发射峰的强度是可独立或半独立控制的。在某些方面，在聚合物基质与一种或多种发色团染料之间存在能量转移。在供选择的方面，在聚合物基质与一种或多种镧系元素发色团染料之间基本上没有能量转移。在一些方面，掺入聚合物基质中的发色团染料被物理嵌入或整合到聚合物基质中。在一些方面，发色团染料与聚合物基质化学交联和/或物理共混。在一些方面，第一发色团染料以第一浓度交联到聚合物基质，并且第二发色团染料以不同于第一浓度的第二浓度交联到聚合物基质。在一些方面，将第一发色团染料与聚合物基质在第一浓度下物理共混，并且将第二发色团染料与聚合物基质在不同于第一浓度的第二浓度下物理共混。在某些方面，发色团染料与发色团聚合物(例如，形成聚合物基质的发色团聚合物)化学交联和/或物理共混。多种发色团染料适合用于与本文所述的编码颗粒。在某些方面，发色团染料是荧光染料。在各个方面，发色团染料是小分子有机染料。荧光染料的实例包括但不限于：bodipy和/或bodipy衍生物、方酸菁和/或方酸菁衍生物、金属络合物和/或金属络合物衍生物、卟啉和/或卟啉衍生物、金属卟啉和/或金属卟啉衍生物、酞菁和/或酞菁衍生物、金属酞菁和/或金属酞菁衍生物、镧系元素络合物和/或镧系元素络合物衍生物、苝和/或苝衍生物、花青和/或花青衍生物、若丹明和/或若丹明衍生物、香豆素和/或香豆素衍生物和/或呫吨和/或呫吨衍生物。在一些方面，所述衍生物选自烷基衍生物、芳基衍生物、炔烃衍生物、芳族衍生物、醇盐衍生物、氮杂衍生物或其类似物。聚电解质涂覆的编码颗粒在一些方面，本文提供的编码颗粒可以具有聚电解质涂层。有利地，聚电解质涂层可以例如改善具有高离子强度、包含二价金属离子或二者的溶液中聚合物颗粒的胶体稳定性。与没有聚电解质涂层的一些聚合物颗粒相比，改善的胶体稳定性例如可以使聚合物颗粒被用于测定而不失去其功能。在某些方面，可以调整聚电解质涂层的成分组成，以减少或消除溶液例如高离子强度溶液中聚合物颗粒的聚集。另外，在某些条件下，溶液中的离子(例如二价离子)可螯合聚合物颗粒的表面上的基团，从而影响聚集性质。在一些方面，聚电解质涂层用于减少或消除溶液中聚合物颗粒的聚集。聚电解质涂层的层厚度可以在约2-4纳米的范围内，从而使包含聚合物颗粒和聚电解质涂层的纳米颗粒的直径增加约4-8纳米。涂层中的聚电解质可以以各种方式在聚合物颗粒的表面上形成。例如，如果使用一种类型的聚电解质，则聚电解质聚合物分子可以物理共混在一起以形成涂层。如果使用两种或更多种类型的聚电解质，则聚电解质聚合物分子可以物理共混在一起以形成涂层，或在一些方面，不同的聚电解质可以在纳米颗粒的表面上形成区域(或筏(raft))。在一些方面，聚电解质可以是化学交联的。例如，可以使用本领域通常公知的任何交联反应使涂层中的一些或全部聚电解质化学交联。聚电解质也可以与形成聚合物颗粒的(多种)缩合聚合物化学交联。在一些方面，涂层可以包括多于一层的聚电解质。例如，涂层可以包括两层聚电解质、三层聚电解质或更多层聚电解质。层中的聚电解质可以包括相同或不同类型的聚电解质。在一些方面，“聚电解质”可以包括例如其重复单元带有带电荷的电解质基团的聚合物。在一些方面，聚电解质可包括其中沿着聚合物的所有重复单元带有电解质基团的聚合物。在某些方面，聚合物的一些重复单元带有电解质基团。例如，本发明的聚电解质可以包括其中聚合物中至少99％、95％、90％>、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的重复单元带有电解质基团的聚合物。在一些方面，本发明的聚电解质可以包括其中聚合物中至少99％、95％、90％、85％或80％的重复单元带有电解质基团的聚合物。在一些方面，聚电解质可以包含至少一种类型的电解质基团。例如，聚电解质可以仅包含一种类型的电解质基团，或两种或更多种类型的电解质基团。本文所述的各种电解质基团可以包含在多种不同类型的聚电解质中。本发明中的示例性聚电解质可以包括但不限于聚(苯乙烯磺酸酯)、聚磷酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯-共聚-马来酸酯、聚丙烯酰胺、壳聚糖、多糖、聚赖氨酸、聚组氨酸和多肽。本文所述的电解质基团可以包含在聚合物主链中，包含在连接到聚合物主链的侧链中，和/或包含在连接到聚合物的侧链的基团中。在本发明中可以使用多种电解质基团。通常，在特定条件下产生电荷的任何基团都可以用于聚电解质。例如，电解质基团可以包括阴离子或阳离子。在一些方面，电解质基团可以包含一种阴离子或一种阳离子。供选择地，电解质基团可以包含多于一种阴离子和/或阳离子，使得电解质基团包含总体上的负电荷或正电荷。电解质基团上的电荷可以是永久电荷，或根据溶液的特定ph产生的电荷(例如，氢可以解离以形成带电的电解质基团)。在一些方面，电解质基团在溶解于水溶液之前可以是盐(例如，用抗衡离子中和)。在一些方面，电解质基团可包括但不限于羧基、磺酸酯基、磷酸酯基、氨基、羟基和巯基。在一些方面，可以根据酸性或碱性溶液的特性产生电解质基团的电荷。例如，羧基、磺酸酯基、磷酸酯基、羟基或巯基可以例如根据溶液的ph和各个电解质基团的pka带负电。在水溶液中，聚合物上的电解质基团可以解离形成带电基团，从而使聚合物带电，形成聚电解质。在一些方面，电解质基团可以被取代基取代以在电解质基团上放置永久电荷。例如，氨基可以包括具有永久正电荷的季铵阳离子。电解质基团的取代基可以变化，例如烷基、芳基、cn、氨基、硫醚基、醛基、酯基、醚基、酸基、羟基或卤素。在某些方面，电解质基团上的取代基可以为电解质提供电荷。本发明的一个方面包括通过提供聚电解质涂层来改变聚合物颗粒的ζ电位。该涂层可用于修饰例如纳米颗粒的表面电荷并防止溶液中的聚集。可以根据溶液调整ζ电位以防止聚集。在一些方面，ζ电位是评价分散在溶液中的颗粒是否可以抵抗聚集的参数。例如，当颗粒(例如，涂覆有聚电解质的聚合物颗粒)的ζ电位是比+30mv更大的正值或比-30mv更小的负值时，所述颗粒将是稳定的(例如，抵抗聚集)。较高的ζ电位值可以提供针对聚集的更高稳定性。例如，具有+/-60mv的颗粒分散体可以提供优异的稳定性。根据本文所述的选择的(多种)聚电解质，本发明包括ζ电位是比约+30mv更大的正值，比约+40mv更大的正值，比约+50mv更大的正值或比约+60mv更大的正值的颗粒分散体(例如，具有聚电解质涂层的聚合物颗粒)。本发明包括ζ电位是比约-30mv更小的负值，比约-40mv更小的负值，比约-50mv更小的负值或比约-60mv更小的负值的颗粒分散体(例如，具有聚电解质涂层的聚合物颗粒)。可以使用本文针对多种聚电解质所述的方法来制备具有带有聚电解质涂层的聚合物颗粒的颗粒。然后可以使用各种技术来确定颗粒分散体的ζ电位，例如通过使用设计用于测量ζ电位的仪器，例如通过malvernzetasizer来确定颗粒分散体的ζ电位。在某些方面，本发明包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包含具有涂层的聚合物颗粒，所述涂层包含多于一种聚电解质聚合物。例如，涂层可以包含两种不同的聚电解质、三种不同的聚电解质、四种不同的聚电解质或者更多种并且以任何期望的比例。编码颗粒的官能化和生物缀合物在一些方面，本发明提供了用于生物分子编码的官能化的编码颗粒。官能化颗粒包括编码颗粒和物理或化学连接到该颗粒的官能团。在一些方面，本发明提供了用官能团官能化的编码颗粒。在一些方面，术语“官能团”是指可以例如通过任何稳定的物理或化学关联连接到编码颗粒，从而使发色团聚合物颗粒的表面可用于缀合或生物缀合的任何化学单元。在一些方面，官能团可以是疏水性官能团。疏水性官能团的实例包括但不限于炔基、应变炔基(strainedalkyne)、叠氮基、二烯基、烯基、环辛炔基和膦基(用于点击化学)。在一些方面，官能团可以是亲水性官能团。亲水性官能团的实例包括但不限于羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、重氮基、醛基、酯基、羟基、羰基、硫酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基、氰酸酯基、琥珀酰亚胺酯基、其取代的衍生物。这样的官能团可以由本领域普通技术人员例如在bioconjugatetechniques(academicpress,newyork,1996或更新版本)中找到，出于所有目的将其内容通过引用整体并入本文。可以在例如第wo2015/081126号pct申请中找到用于本文所述的方法和系统的官能化方法和用于生物缀合的合适部分的实例，其通过引用并入本文。用于制备编码颗粒的方法在一些方面，公开了制备编码颗粒的方法。在一些方面，可以使用纳米沉淀形成发色团聚合物颗粒。纳米沉淀方法涉及将聚合物在良溶剂中的溶液引入不良溶剂中，其中溶解度的变化使聚合物塌陷成颗粒形式。在某些方面，可以使用细乳液方法、溶剂混合方法、使用乳液的方法或沉淀方法来制备发色团聚合物颗粒。用于制备用于本文所述的方法和系统的编码颗粒的这些和其他方法的实例可以在例如第wo2015/081126号pct申请中找到，其通过引用并入本文。可检测代码和信号如本文所使用，“可检测代码”可以指由分子(例如，编码颗粒或发色团)自身或响应刺激，例如由电磁辐射源的激发，产生的可识别或可量化的信号。由编码颗粒产生的可检测代码可以包含光学可检测代码。在一些情况下，光学可检测代码可以是荧光信号(例如，由诸如聚合物点、量子点或荧光团的荧光分子产生的)。在一些情况下，光学可检测代码可以是发光信号。在一些情况下，可检测代码可以是比色信号，例如可以由酶促染料产生的比色信号。可检测代码的一个或多个方面(例如，发射波长、发射寿命、发射强度、光谱强度或其任意组合)可以在数字测定期间被测量和/或量化。可检测代码的任何方面(或其组合)可用于为分隔体积分配值。例如，由在包含靶分子的分隔体积中的探针的编码颗粒产生的光谱强度信号的检测、测量或确定(例如，计算)可用于为分隔体积分配值。在一些情况下，检测可检测代码或信号可以包括检测由发色团或编码颗粒在特定波长或波长范围或波长谱发射的辐射强度。例如，检测可检测代码或信号可以包括检测荧光信号，所述荧光信号具有高于阈值或在波长范围内的限定强度范围内的强度。检测可检测代码的非限制性实例可以包括使用检测器和带通滤波器来检测在由带通滤波器限定的波长范围内的荧光信号。在一些情况下，检测可检测代码或信号可以包括在发色团或编码颗粒的发射峰波长处或在包含发色团或编码颗粒的发射峰波长的范围内检测信号强度。在一些情况下，检测可检测代码或信号可以包含检测光谱强度。检测、测量或计算由探针产生的可检测代码或信号的光谱强度可以包括检测或测量在多个发射波长处或在多个发射波长范围内的发射强度。在一些情况下，检测、测量或计算光谱强度可以包括确定或计算多个检测到的发射强度之间的比率。例如，可检测代码或信号的光谱强度可以是在其下或在其中检测到第一发射强度(例如，大于或等于阈值或在限定的强度范围内的发射强度)的第一波长或第一波长范围与在其下或在其中检测到第二发射强度(例如，大于或等于阈值或在限定的强度范围内的第二发射强度)的第二波长或第二波长范围的比率。在一些情况下，包括光谱强度的比率可以独特地确定分隔体积中的探针类型。例如，可以将能够产生具有信号波长的第一比率的光谱强度的第一探针与能够产生具有信号波长的第二比率的光谱强度的第二探针区分开。因此，可以通过分别检测、测量和/或计算由第一和第二探针产生的第一和第二光谱强度，(例如，通过包括本文所述的靶分子依赖性扩增步骤的方法)检测并区分分隔体积中第一和第二靶分子的存在。其中第一和第二探针能够在第一和第二靶分子的存在下分别产生第一和第二光谱强度。在一些情况下，其中在数字测定中使用多个独特探针(例如，包含不同组的发色团或编码颗粒的多个探针)，每个独特探针的光学可检测代码可以就其发射峰强度、发射峰波长、发射强度范围、该独特探针类型的发射波长范围或光谱特征、发射寿命、光谱强度或其组合不同于另一个独特探针。也就是说，在包含多个独特探针、独特编码颗粒或独特发色团的数字测定中，每个独特探针、独特编码颗粒或独特发色团可以具有不同组的发射峰强度、发射峰波长、发射寿命、光谱强度或其组合。光学可检测代码可以包括编码颗粒的表观空间尺寸的表示。也就是说，作为一个实例，光学可检测代码信号的直径差异可以指示靶分子的存在。例如，如图6l中所示，pcr相关的扩增事件可以引起多个探针彼此关联，增加信号的表观空间尺寸。信号的表观空间尺寸的增加可以由发射的荧光或发光信号的增加(例如，编码颗粒数量的增加)引起。例如，从单个颗粒610的直径到关联的(例如，聚集的、相互杂交的或晶格化的)颗粒620的直径的发色团颗粒的直径的差。因为聚集的、相互杂交的或晶格化的颗粒包含更多的发射体，所以聚集的、相互杂交的或晶格化的颗粒可以更亮或看起来更亮(例如，如通过检测器测量的)。然而，应注意，根据连接探针的结合区的长度，从编码颗粒检测到的最大信号强度的轻微下降还可以伴随光学可检测代码信号的表观尺寸的增加(例如由于编码聚合物点彼此的接近度增加)。此外，与在该情况下与之关联的其他编码颗粒相比，彼此关联的探针的编码颗粒可以产生相同或不同的光学可检测代码。编码颗粒的光学性质在一些方面，本发明提供了光学编码系统。在某些方面，光学编码系统包括具有彼此可区分的光学可检测代码的第一编码颗粒和第二编码颗粒。在某些方面，所述系统包括多个编码颗粒，其中至少一些具有彼此可区分的光学可检测代码。本发明的某些方面提供了适合用作编码平台的发色团聚合物颗粒。在一些方面，本发明提提供了能够光学编码和/或生物分子编码的发色团聚合物颗粒，在本文中也称为“编码颗粒”或“编码聚合物颗粒”。在一些方面，编码颗粒具有光学可检测代码，在本文中也称为“光学代码”或“光学编码”，其使颗粒能够在光学上与具有不同代码的颗粒区分开。各种类型的光学编码方案适合用于本文描述的编码颗粒。在某些方面，光学可检测代码包括聚合物颗粒的一种或多种光学性质，例如聚合物颗粒的预定发射光谱(例如，发射波长、发射强度)、聚合物颗粒的预定发射寿命、预定发射速率、预定吸收波长或其组合。因此，可以通过测量其光学性质来独特地确定编码颗粒，以便确定相应的代码。在本发明的各个方面，光学可检测代码由编码颗粒的发色团限定。编码颗粒可以包括本文提供的任何合适数量和组合的各种发色团组成。例如，适合用于本发明的示例性发色团包括但不限于发色团聚合物(例如，形成颗粒的聚合物基质的一种或多种发色团聚合物，例如窄带发色团聚合物)、镧系元素发色团(例如，镧系元素离子、镧系元素络合物、镧系元素纳米颗粒或其他镧系元素材料)或发色团染料(例如，荧光染料、发光染料)，如本文进一步描述的。在一些方面，由于发色团聚合物用作聚合物基质的独特特征，本发明提供了用于编码的发色团颗粒，其中整个颗粒由发色团(例如荧光和/或发光材料，例如发色团聚合物、镧系元素发色团或发色团染料)组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多90％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多80％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多70％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多60％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多50％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多40％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多30％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多20％由发色团组成。在一些方面，每个颗粒的质量的至多10％由发色团组成。在一些方面，编码颗粒包含多个独特发色团，并且所述多个独特发色团的组合质量为聚合物颗粒的总质量的1％至99％、10％至99％、20％至99％、30％至99％、40％至99％或50％至99％。在某些方面，发色团可以是单独的发色团聚合物。在其他方面，发色团可以包括与其他发色团类型物理共混或化学交联的发色团聚合物，所述其他发色团类型例如镧系元素材料，如镧系元素离子、镧系元素络合物、镧系元素纳米颗粒，发色团染料，例如荧光染料，或其组合。在一些方面，编码颗粒包括用于限定光学可检测代码的一个或多个独特发色团(例如，具有不同结构、组成和/或性质的发色团)。编码颗粒可以包括任何合适数量和组合的独特发色团类型，例如仅单个独特发色团、两个或更多个独特发色团、三个或更多个独特发色团、四个或更多个独特发色团、五个或更多个独特发色团、六个或更多个独特发色团、七个或更多个独特发色团、八个或更多个独特发色团、九个或更多个独特发色团、十个或更多个独特发色团、二十个或更多个独特发色团、五十个或更多个独特发色团或一百个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含所述多个独特发色团中的任何独特发色团之间固定的质量比，例如在两个或更多个独特发色团、三个或更多个独特发色团、四个或更多个独特发色团、五个或更多个独特发色团、六个或更多个独特发色团、七个或更多个独特发色团、八个或更多个独特发色团、九个或更多个独特发色团、十个或更多个独特发色团、二十个或更多个独特发色团、五十个或更多个独特发色团或一百个或更多个独特发色团之间固定的质量比。在某些方面，独特发色团具有可彼此区分的一种或多种光学性质(例如，发射光谱、发射强度、发射波长、发射寿命、发射速率、吸收波长等)。例如，编码颗粒可以包含(例如，由至少一种发色团聚合物形成的)聚合物基质和一个或多个光学性质可区别于聚合物基质的光学性质的发色团(例如，镧系元素发色团)。在一些方面，编码颗粒包含具有彼此可区分的发射光谱的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含具有彼此可区分的发射强度的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含具有彼此可区分的发射波长的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含具有彼此可区分的发射寿命的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在某些方面，独特发色团具有可独立或半独立控制的一种或多种光学性质(例如，发射光谱、发射强度、发射波长、发射寿命等)。在一些方面，编码颗粒包含具有可独立或半独立控制的发射光谱的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含具有可独立或半独立控制的发射强度的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗粒包含具有可独立或半独立控制的发射波长的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在一些方面，编码颗包含具有可独立或半独立控制的发射寿命的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个独特发色团。在某些方面，在本文中可称为“光学编码参数”的发色团的各种光学性质是可调节的，以获得多个独特光学代码(例如，光学上可彼此区分的光学代码)。如本文进一步所述，发色团的可调节光学编码参数可以包括发色团的一种或多种光学性质，例如发射峰强度、发射峰强度范围、发射峰波长(例如，发射峰波长或发射波长范围)、发射寿命、发射速率、吸收波长(例如，吸收峰波长或吸收波长范围)或其组合。在某些方面，每个独特发色团的可调节光学编码参数是预先确定的(例如，具有基于发色团的结构和/或组成预先确定的值、曲线、特征等)，以便提供聚合物颗粒的确定的光学可检测代码。各种数量和组合的可调节光学编码参数适合用于本文所述的方法。在一些方面，发色团的一组可调节光学编码参数仅包括单个可调节光学编码参数。在其他方面，一组可调节光学编码参数包括至少两个独特的可调节光学编码参数、至少三个独特的可调节光学编码参数、至少四个独特的可调节光学编码参数、至少五个独特的可调节光学编码参数、至少六个独特的可调节光学编码参数、至少七个独特的可调节光学编码参数、至少八个独特的可调节光学编码参数、至少九个独特的可调节光学编码参数、至少十个独特的可调节光学编码参数、至少二十个独特的可调节光学编码参数、至少五十个独特的可调节光学编码参数或至少一百个独特的可调节光学编码参数。在某些方面，每个独特发色团与一组可调节光学编码参数相关联，并且至少一些组的可调节光学编码参数是可独立或半独立调节或调制的。在一些方面，“独立调节”是指一个可调节光学编码参数不受另一个可调节光学编码参数的影响(例如，一组发射峰不受另一组发射峰的影响)。在一些方面，“半独立调节”是指一个可调节光学编码参数可以受到另一个可调节光学编码参数的影响(例如，一组发射峰可以受到另一组发射峰的影响)。“半独立调节”的光学编码参数的实例包括其中采用能量转移来调整和调节聚合物颗粒的发射强度的情况，其中聚合物颗粒包括供体分子和受体分子。例如，在一些方面，两个或更多个独特发色团、三个或更多个独特发色团、四个或更多个独特发色团、五个或更多个独特发色团、六个或更多个独特发色团、七个或更多个独特发色团、八个或更多个独特发色团、九个或更多个独特发色团、十个或更多个独特发色团、二十个或更多个独特发色团、五十个或更多个独特发色团或一百个或更多个独特发色团的可调节光学编码参数组是可独立或半独立调节或调整的。可以基于任何合适数量和组合的可调节光学编码参数来限定编码颗粒的光学可检测代码。在一些方面，根据单个可调节光学编码参数(例如，发射峰波长(“波长编码”)、发射峰强度(“强度编码”)、发射寿命(“寿命编码”)，等等)来限定光学可检测代码。发射峰在通常以峰最大值为中心的波长范围内包括各种峰强度。在光学可检测代码包括发射峰强度的情况下，它可以处于对应发射峰的最大发射强度的点或在较小发射强度的点。因此，发射峰强度对应于发射峰的任何部分在给定波长处的发射强度。在一些方面，根据两个可调节光学编码参数(例如，发射峰波长和发射峰强度(“波长-强度编码”)或发射峰波长和发射寿命(“波长-寿命编码”))限定光学可检测代码。在供选择的方面，根据三个可调节光学编码参数(例如，发射峰波长、发射峰强度和发射寿命(“波长-强度-寿命编码”))限定光学可检测代码。在一些方面，根据四个可调节光学编码参数、五个可调节光学编码参数、六个可调节光学编码参数、七个可调节光学编码参数、八个可调节光学编码参数、九个可调节光学编码参数、十个可调节光学编码参数或大于十个可调节光学编码参数来限定光学可检测代码。在某些方面，光学可检测代码包括预定的一组编码颗粒的发射峰。在一些方面，编码的发色团颗粒的化学组成和结构包含至少两种独特发色团(例如，至少一种类型的发色团聚合物和一种类型的镧系元素发色团，至少一种类型的发色团聚合物和一种类型的荧光染料)，对其进行调节以获得至少两组聚合物颗粒的发射峰。在一些方面，编码颗粒具有至少两组、至少三组、至少四组、至少五组、至少六组、至少七组、至少八组、至少九组或至少十组通过调节发色团的相应数量产生的发射峰。在一个优选的方面，发色团聚合物颗粒可以具有多组，例如2-10组分辨率良好的发射峰，其中任何两个相邻的发射峰不具有光谱重叠。每个发射峰的强度水平可以通过调节颗粒组成和/或聚合物结构独立调节。然而，在某些方面，发色团聚合物颗粒可以具有多个发射峰，并且在两个相邻的发射峰之间可能存在一些光谱重叠。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的1％。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的5％。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的10％。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的20％。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的30％。在一些方面，重叠面积小于两个相邻峰中任一个的积分面积的40％。在另一个优选的方面，编码颗粒可以具有多组，例如2-10组发射峰，并且每个峰源自颗粒中的一个发色团(例如，荧光物质)。在某些方面，每个发射峰的强度水平可以例如通过调节颗粒组成和/或聚合物结构独立调节。在某些方面，发色团聚合物颗粒可以具有多个发射峰，但是两个或多于两个发射峰可以源自一种发色团物质，而其他发射峰源自不同的物质。来自一种发色团物质的发射峰的强度水平可以通过调整颗粒组成和聚合物结构进行关联和调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒在一个波长激发下显示出多组，例如2-10组发射峰。在一些方面，发色团聚合物颗粒在两个波长激发下显示出多组发射峰。在一些方面，发色团聚合物颗粒在三个波长激发下显示出多组发射峰。在一些方面，发色团聚合物颗粒在四个或更多个波长激发下显示出多组发射峰。然而，每组发射峰的发射强度可以通过改变颗粒组成和聚合物结构独立或半独立地调节，例如，一组发射峰或多个发射峰相对于任何其他峰的相对强度可以独立或半独立地改变。在某些方面，可以对该组编码颗粒的发射峰组的发射强度和/或发射波长进行调节，从而实现基于峰波长和/或强度编码。例如，在一些方面，波长编码方案提供了通过改变编码颗粒的发射峰的发射波长限定的多个光学可检测代码。聚合物颗粒的发射波长可以从紫外区域到近红外区域变化。在一些方面，聚合物颗粒的每组发射峰或多个发射峰的发射波长能够独立地或半独立地调节。颗粒的每组发射峰或多个峰的发射强度可以独立或半独立地调节和调整。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括两组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括三组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括四组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括五组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括六组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括多于六组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括最多十组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括多于十组发射峰，其中它们的波长可以独立地或半独立地调节。在一些方面，强度编码方案提供了通过改变编码颗粒的发射峰的发射强度水平限定的多个光学可检测代码。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括两组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括三组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括四组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括五组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括六组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括大于六组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括最多十组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，发色团聚合物颗粒包括大于十组发射峰，其中它们的强度水平可以独立地或半独立地调节。在一些方面，波长-强度编码方案通过改变编码颗粒的发射波长和发射峰的发射强度水平来提供多个光学可检测代码。波长-强度编码方案可以是本文提供的波长编码方案和强度编码方案的任何合适的组合。在一些方面，本发明提供了能够进行寿命编码，例如，具有基于聚合物颗粒的发射寿命限定的光学可检测代码的编码颗粒。在一些方面，荧光寿命被定义为分子(或颗粒)在发射光子之前停留在其激发态的平均时间。荧光寿命可以由荧光团的单指数衰减函数的时间常数或多指数衰减函数的平均时间常数依实验确定。在某些方面，编码颗粒能够进行波长-强度-寿命编码，也称为波长-强度-寿命多路复用。由于颜色和强度编码可以受到光谱重叠和背景干扰的限制，因此寿命编码提供了额外的编码维度。可以通过改变编码颗粒的组成来生成可区分的寿命代码。对于每个单色发射带，可以产生大量编码颗粒并将其用作具有10皮秒至1毫秒的独特寿命的寿命代码。在一些方面，编码颗粒具有多组，例如2-10组发射峰，并且每组发射峰或多个发射峰具有彼此不同的荧光或发光寿命。寿命可以从10皮秒到1毫秒不等。在一些方面，寿命从10皮秒到100皮秒不等。在一些方面，寿命从100皮秒到1纳秒不等。在一些方面，寿命从1纳秒到10纳秒不等。在一些方面，寿命从10纳秒到100纳秒不等。在一些方面，寿命从100纳秒到1微秒不等。在一些方面，寿命从1微秒到10微秒不等。在一些方面，寿命从10微秒到100微秒不等。在一些方面，寿命从100微秒到1毫秒不等。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物，其具有10皮秒到1毫秒范围的独特寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物和至少一种类型的染料分子，其中发色团聚合物或染料分子中的任一种具有10皮秒到1毫秒范围内的独特寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物和至少两种类型的染料分子，其中发色团聚合物或染料分子中的任一种具有10皮秒到1毫秒范围内的独特寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物和至少一种类型的镧系元素材料(例如，镧系元素发色团)，发色团聚合物或镧系元素材料具有10皮秒至1毫秒范围内的独特寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物、至少一种类型的染料分子和至少一种类型的镧系元素材料。发色团聚合物、染料分子和镧系元素材料中的任一种可以具有10皮秒至1毫秒范围内的独特寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物用于寿命编码。可以改变单体结构、单体种类和浓度以调节编码颗粒的寿命。编码颗粒可以包含两种或更多种类型的发色团聚合物，以产生多种发光颜色，并且每种发光颜色可以独立地用于产生寿命代码。发色团聚合物之间的能量转移可以用于调节编码颗粒的寿命。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物和至少一种类型的发色团染料用于寿命编码。可以独立使用聚合物的发射或染料的发射中的任一种，以产生10皮秒至1毫秒范围的寿命代码。发色团聚合物与染料分子之间的能量转移可以用于调整编码颗粒的寿命。染料分子可以与发色团聚合物物理关联或化学连接。可以改变染料和聚合物的结构、组成和浓度，以调节编码颗粒的寿命。编码颗粒可以包括两种或更多种类型的染料分子以产生多种发光颜色，并且每种发光颜色可以独立地用于产生寿命代码。对于每个单色发射带，可以产生许多发色团聚合物颗粒，并将其用作具有从10皮秒到1毫秒不等的独特寿命的寿命代码。在一些方面，寿命从10皮秒到100皮秒不等。在一些方面，寿命从100皮秒到1纳秒不等。在一些方面，寿命从1纳秒到10纳秒不等。在一些方面，寿命从10纳秒到100纳秒不等。在一些方面，寿命从100纳秒到1微秒不等。在一些方面，寿命从1微秒到10微秒不等。在一些方面，寿命从10微秒到100微秒不等。在一些方面，寿命从100微秒到1毫秒不等。染料掺杂的发色团聚合颗粒可用于产生许多寿命代码。在又一方面，本发明提供了具有受控的颗粒间能量转移的编码颗粒。因为每个颗粒都具有来自不同荧光或发光材料的多组发射峰，所以在一些方面希望控制颗粒间的能量转移，以便可以调节每个峰或每组峰的强度水平。在一些方面，完全阻止了颗粒间能量转移，从而可以独立地调节每组发射峰。在一些方面，部分地允许颗粒间能量转移产生不同的发光颜色和强度水平。在一些方面，在编码颗粒的两个或更多个独特发色团之间有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的能量转移。在一些方面，在编码的发色团聚合物颗粒的两个或更多个独特发色团之间基本上没有能量转移。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于50％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于40％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于30％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于20％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于10％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于5％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于4％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于3％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于2％。在一些方面，存在的任何发色团之间的能量转移小于1％。在一些方面，存在的任何发色团之间基本上没有能量转移。在一些方面，存在的任何发色团之间没有可检测的能量转移。在一些方面，编码颗粒包含至少一种类型的发色团聚合物用于生物分子编码。编码颗粒可以包含一种或多种类型的缀合聚合物(例如，半导体聚合物)。编码颗粒具有至少两组发射峰。聚合物颗粒的发射波长可以从紫外到近红外区域变化。颗粒的每组发射峰或多个发射峰的发射强度可以独立或半独立地调节和调整。示例性发色团聚合物组合物在本文中进一步描述。在一些方面，编码颗粒包括两组发射峰；一组发射峰来自能量供体，另一组发射峰来自能量受体，并且它们的强度水平可以通过能量转移半独立地调节。在一些方面，供体的发射强度大于受体的发射强度。在一些方面，供体的发射强度小于受体的发射强度。在某些方面，编码颗粒可以通过其稳定性来表征。光学性质(例如，发射光谱、发射带宽、荧光或发光量子产率、荧光或发光寿命、特定波长下的发射强度)在1天、或1周、或2周、或1个月、或2个月、或3个月、或6个月、或1年、或更长时间内是稳定的。稳定的荧光或发光量子产率是指颗粒的荧光或发光量子产率的改变不超过5％、或10％、或20％、或50％、或更高。稳定的发射光谱意味着每个峰相对于其他发射峰的强度比的变化不超过5％、或10％、或20％、或50％、或更高。在一些方面，编码颗粒具有以下特征中的一些或全部：(1)多组，例如2-10组分辨率良好的发射峰，具有最小的光谱重叠；(2)通过调节颗粒组成和聚合物结构来调节每组发射峰的强度水平；(3)高荧光或发光量子产率，其大于5％、优选大于10％、优选大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％；(3)每组发射峰具有彼此不同的荧光或发光寿命；(4)在至少2周、优选1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长时间内具有高稳定性。如本文进一步所述，编码颗粒显示多组发射峰，通过改变聚合物和镧系元素材料(镧系元素离子、镧系元素络合物或镧系元素纳米颗粒)的组成独立地或半独立地调节其发射强度。在一些方面，镧系元素材料相对于整个颗粒质量的质量浓度高于10％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于20％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于30％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于40％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于50％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于60％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于70％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于80％。在一些方面，镧系元素材料的质量浓度高于90％。在一些方面，一种或多种镧系元素发色团的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更短的波长。在一些方面，一种或多种镧系元素发色团的(多个)发射峰具有比聚合物基质的(多个)发射峰更长的波长。在一些方面，编码颗粒显示具有其发射寿命(例如，荧光或发光发射寿命或光谱强度寿命)的多组发射峰。在一些情况下，可以通过改变聚合物和镧系元素材料(镧系元素离子、镧系元素络合物或镧系元素纳米颗粒)的组成来独立或半独立地调节发射寿命。每组发射峰或多个发射峰具有与其它的不同的发射寿命。寿命可以从10皮秒到1毫秒不等。在一些方面，寿命可以从10皮秒到100皮秒不等。在一些方面，寿命可以从100皮秒到1纳秒不等。在一些方面，寿命可以从1纳秒到10纳秒不等。在一些方面，寿命可以从10纳秒到100纳秒不等。在一些方面，寿命可以从100纳秒到1微秒不等。在一些方面，寿命可以从1微秒到10微秒不等。在一些方面，寿命可以从10微秒到100微秒不等。在一些方面，寿命可以从100微秒到1毫秒不等。基于这些性质，可以将编码颗粒用于波长-强度-寿命编码。例如，我们可以通过时间门控检测或成像将发色团聚合物的荧光与镧系元素的荧光分开。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物和至少一种类型的镧系元素材料用于寿命编码。镧系元素材料包括镧系元素络合物、镧系元素离子和镧系元素纳米颗粒。聚合物的发射或镧系元素的发射中的任一种可以独立使用，以产生10皮秒至1毫秒范围的寿命代码。发色团聚合物和镧系元素材料之间的能量转移可以用于调节编码颗粒的寿命。不同的镧系元素离子之间的能量转移也可以用于调节编码颗粒的寿命。镧系元素纳米颗粒内部的能量转移也可以用于调节编码颗粒的寿命。镧系元素材料可以与发色团聚合物物理关联或化学连接。可以改变镧系元素材料和聚合物的结构、组成和浓度，以调节编码颗粒的寿命。编码颗粒可以包含两种或更多种类型的镧系元素材料以产生多种发光颜色，并且每种发光颜色可以独立地用于产生寿命代码。对于每个单色发射带，可以产生大量发色团聚合物颗粒并将其用作具有10皮秒至1毫秒范围的独特寿命的寿命代码。在一些方面，寿命从10皮秒到100皮秒不等。在一些方面，寿命从100皮秒到1纳秒不等。在一些方面，寿命从1纳秒到10纳秒不等。在一些方面，寿命从10纳秒到100纳秒不等。在一些方面，寿命从100纳秒到1微秒不等。在一些方面，寿命从1微秒到10微秒不等。在一些方面，寿命从10微秒到100微秒不等。在一些方面，寿命从100微秒到1毫秒不等。在一些方面，编码颗粒可以包含至少一种类型的发色团聚合物、至少一种类型的染料分子和至少一种类型的镧系元素材料用于寿命编码。镧系元素材料包括镧系元素络合物、镧系元素离子和镧系元素纳米颗粒。聚合物的发射或染料的发射或镧系元素的发射中的任一种可以独立使用，以产生范围为10皮秒至1毫秒的寿命代码。发色团聚合物和镧系元素材料之间的能量转移可用于调节编码颗粒的寿命。聚合物和染料之间的能量转移也可以用于调节编码颗粒的寿命。镧系元素材料和染料之间的能量转移也可以用于调节编码颗粒的寿命。镧系元素纳米颗粒内部的能量转移也可以用于调节编码颗粒的寿命。染料分子、镧系元素材料和发色团聚合物可以彼此物理关联或化学连接。可以改变聚合物、染料和镧系元素材料的结构、组成和浓度，以调节编码颗粒的寿命。编码颗粒可以包含两种或更多种类型的镧系元素材料和两种或更多种类型的染料，以产生多种发光颜色，并且每种发光颜色可以独立地用于产生寿命代码。对于每个单色发射带，可以产生大量发色团聚合物颗粒并将其用作具有范围为10皮秒至1毫秒的独特寿命的寿命代码。在一些方面，寿命从10皮秒到100皮秒不等。在一些方面，寿命从100皮秒到1纳秒不等。在一些方面，寿命从1纳秒到10纳秒不等。在一些方面，寿命从10纳秒到100纳秒不等。在一些方面，寿命从100纳秒到1微秒不等。在一些方面，寿命从1微秒到10微秒不等。在一些方面，寿命从10微秒到100微秒不等。在一些方面，寿命从100微秒到1毫秒不等。包含染料分子和镧系元素络合物的编码颗粒可以用于产生许多寿命代码。在一些方面，编码颗粒的其他可调节光学性质可以用作光学编码的基础。例如，光学可检测代码可以基于聚合物颗粒的全部荧光或发光量子产率。在给定的激发波长下，编码颗粒的全部荧光或发光量子产率可以100％到1％不等。在一些方面，量子产率大于约90％。在一些方面，量子产率大于约80％。在一些方面，量子产率大于约70％。在一些方面，量子产率大于约60％。在一些方面，量子产率大于约50％。在一些方面，量子产率大于约40％。在一些方面，量子产率大于约30％。在一些方面，量子产率大于约20％。在一些方面，量子产率大于约10％。在一些方面，量子产率大于约5％。在一些方面，量子产率大于约1％。在其他方面，光学可检测代码可以基于编码颗粒的发色团的发射速率。在某些方面，发色团的发射速率在约10皮秒至约100皮秒、约100皮秒至约1纳秒、约1纳秒至约10纳秒或约10纳秒至约100纳秒的范围内。在其他方面，光学可检测代码可以基于编码颗粒的吸收性质。吸收峰可以从紫外区域移动到近红外区域。在一些方面，编码颗粒具有一个吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有两个吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有三个吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有多于三个吸收峰。可以将编码颗粒的吸收峰调节到特定激光波长。在一些方面，例如，吸收峰为约266纳米。在一些方面，吸收峰为约355纳米。在一些方面，吸收峰为约405纳米。在一些方面，吸收峰为约450纳米。在一些方面，吸收峰为约488纳米。在一些方面，吸收峰为约532纳米。在一些方面，吸收峰为约560纳米。在一些方面，吸收峰为约635纳米。在一些方面，吸收峰为约655纳米。在一些方面，吸收峰为约700纳米。在一些方面，吸收峰为约750纳米。在一些方面，吸收峰为约800纳米。在一些方面，吸收峰为约900纳米。在一些方面，吸收峰为约980纳米。在一些方面，吸收峰为约1064纳米。在一些方面，编码颗粒具有约200纳米至约300纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约300纳米至约400纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约400纳米至约500纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约500纳米至约600纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约600纳米至约700纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约700纳米至约800纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约800纳米至约900纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约900纳米至约1000纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约1000纳米至约1100纳米的吸收峰。在一些方面，编码颗粒具有约1100纳米至约1200纳米的吸收峰。样品的数字分析分隔体积在某些方面，本发明的方法和系统可以用于分析分隔体积中的样品。术语“数字化体积”是指在获取初始样品并将其分离成物理上明显较小体积为测定做准备后产生的体积。如本文所使用的，术语“分隔体积”是指由空间边界限定的液体的体积，使得两个分隔体积的内容物不容易混合。分隔体积可以是数字化体积。分隔体积的空间边界的非限制性示例包括固体结构(例如，试管的壁或微量滴定板的孔的壁)、不溶性液体的界面(例如，油水界面)或气液界面(例如，平坦表面上的液体分隔体积)。分隔体积、等分试样、数字化体积以及孔或腔室中的液体都可以是分隔体积。分隔体积可以是相同的尺寸(单分散)，或者它们可以是不同的尺寸(多分散)。本发明提供了可以用于分隔体积的产生、操作、分析和建模的装置、系统和设备。还提供了相关方法。本发明还包括用于通过使用数字量化平台对分隔体积进行高通量分析的方法和系统。在实现使用多分散系统的数字测定的同时，本发明也可以应用于使用单分散系统的数字测定。本发明还包括用于乳液分布建模、数据获取和乳液生成的方法。本发明的一些实施方案包括在不混溶的流体中产生分隔体积。如本领域中众所周知的，可以将多种不混溶的流体组合以产生不同体积的分隔体积。如本文进一步描述的，可以通过各种方式，例如通过乳化来组合流体。例如，水溶液(例如水)可以与非水流体(例如油)组合以在诸如微流体芯片的容器中产生分隔体积。适合用于本发明的水溶液可包括水基溶液，其还可包含缓冲液、盐和通常已知用于检测测定(例如pcr)中的其他组分。因此，本文所述的水溶液可以包含例如引物、核苷酸和探针。合适的非水流体可以包括但不限于有机相流体，如矿物油(例如，轻质矿物油)、硅油、氟化油或流体(例如，氟化醇或fluorinert)、其他市售材料(例如)、聚丁烯或其组合。除了水溶液和非水流体之外，还可以包含表面活性剂以例如改善分隔体积的稳定性和/或促进分隔体积形成。合适的表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂、离子表面活性剂、基于硅氧烷的表面活性剂、氟化表面活性剂或其组合。非离子表面活性剂可以包括，例如，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(span60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(tritonx-100)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(tween80)和脱水山梨糖醇单油酸酯(span80)。基于硅氧烷的表面活性剂可以包括例如abilwe09表面活性剂。可以类似地使用本领域中通常公知的其他类型的表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂可以各种浓度或浓度范围存在，例如按重量计约0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、5％或10％。用于数字测定的分隔体积的形成分隔体积可以以各种方式产生，随机地或通过微流体的受控应用来产生。在一些情况下，可通过使流体(例如，水相)流动通过微流体装置来产生分隔体积，所述微流体装置可包括通道和隔室的网络。例如，产生分隔体积的方法可以包括使水相流动通过微流体装置，该微流体装置包括预填充有油相的自数字化装置(例如，包括腔室或孔的阵列的微流体芯片)，并且随后使另外的油相流动通过装置。使水相流动可以从隔室置换油相。在一些情况下，使额外的油相流动通过该装置可从通道置换剩余的水相。在一些情况下，在使水相流动通过装置之后使另外的油相流动通过该装置可以“盖住”水相并使该水相分隔在装置的一个或多个腔室内。例如，在使水相流动通过装置之后使另外的油相流动通过该装置可以将水相捕获在该装置的腔室的部分中。在一些情况下，可通过使流体(例如，水相)流动通过微流体装置来产生分隔体积，该微流体装置可包括孔或通道的阵列。例如，一种产生分隔体积的方法可以包括使水相流动通过微流体装置，该微流体装置包括连接到腔室的孔或通道的阵列，该腔室的高度与孔或通道的阵列的高度不同，并且二者均预填充有油相。使水相流动通过孔或通道的阵列将导致在孔/通道与腔室之间的界面处或周围形成小滴。所形成的小滴的尺寸可以是多分散的，即，体积的变化大于两倍或大于100％。形成的小滴的尺寸可以是单分散的，即，体积变化小于0.3倍或小于30％。也可以在流动连接处(例如，在水相和油相相遇处)产生分隔体积。例如，可以在微流体装置内的t形连接处形成分隔体积，在所述t形连接处第一流体(例如，水相)从微流体装置的第一通道(例如，侧通道)流入微流体装置的第二通道(例如，主通道)，第二流体(例如，油相)可位于所述微流体装置的第二通道中或第二流体可以流动通过所述微流体装置的第二通道。在一些情况下，在连接处的会聚流(例如，汇合流)可以在第二流体内产生第一流体的分隔体积(例如，小滴或塞)。在一些情况下，第一流体(例如，水相)可以在微流体装置的连接处与多种流体接触或会聚。第一流体在连接处接触或会聚的多种流体中的一种或多种可以是油相。例如，当水性流体在十字形连接(例如，加号形或十字形连接)处与两种油相(例如，以“流动聚焦”方式)接触或会聚时，可以形成分隔体积。在一些情况下，第一和第二流体(例如，水相和油相)可以在同轴连接处汇合，该同轴连接处可以是在其中来自第一通道(例如，内部通道)的第一流体被来自第二通道(例如，围绕第一通道的外部通道)的第二流体(例如，油相)的鞘流包围，导致多个分隔体积(例如，多个小滴)的形成的界面。例如，通过使第一流体流动通过孔或通道并进入第二流体，可以使第一流体(例如，水相)分散到第二流体(例如，油相)中，从而在第二流体内形成包含第一流体的多个分隔体积。在一些情况下，通过使第一流体流动通过多个孔或通道并进入第二流体中，可以同时产生多个分隔体积(例如，小滴)。例如，可以通过使第一流体流动通过多孔膜或微流体过滤器并进入第二流体来形成多个分隔体积。在一些情况下，可以通过使第一流体流动通过平行的阶跃连接(stepjunction)或分离通道并进入第二流体来形成多个分隔体积。在一些情况下，可以使容器(例如管、微管或微量离心管)内包含的第一流体(例如水相)和第二流体(例如油相)经受剪切力(例如，通过搅拌或涡旋)，以在容器内部产生多个分隔体积(例如，在油相内包含多个水相小滴的乳液)。在一些情况下，可以通过超声将剪切力引入第一和/或第二流体中。在一些情况下，可以通过迫使(例如，通过快速和/或反复吸移第一和第二流体的混合物)第一和第二流体流动通过颈缩部来形成乳液(例如，第二流体内部的多个第一流体的小滴)。也可以通过使物体或结构(不锈钢球)在包含第一和第二流体的容器内移动来形成分隔体积。可以使用各种方法在容器内移动物体或结构以引起分隔体积的形成，所述方法例如搅拌、磁力振荡、物理摇动/搅动容器，或本文所述的任何其他方法。在一些实施方案中，可以通过在装置的入口或近端与装置的出口或远端之间产生压力差来诱导在装置中或通过装置(例如，微流体装置)的流体流动。可以通过对入口施加正压力和/或对出口施加真空压力来产生压力差。在一些情况下，装置可以经受离心力(例如，通过使装置的全部或部分旋转，例如在旋转的转子上)来帮助诱导流体流动。使用诸如此类的方法来诱导流体流动可以导致更高密度的流体通过装置内的更低密度的流体。在一些情况下，更高密度的流体可以是水相。在一些情况下，更低密度的流体可以是油相。可以使用多种方法来产生不同尺寸(例如直径、体积等)的分隔体积。在一些方面，可以使用阀、孔或腔室来产生分隔体积。可以使用微流体技术(例如，使用如本领域中众所周知的t形通道或流动聚焦)来产生限定尺寸的分隔体积。在一些情况下，可以通过改变剪切速率或通道尺寸来形成不同尺寸的分隔体积。借助于不同的表面活性剂，通过乳化也可以产生不同尺寸的分隔体积。在一些情况下，可以通过使用不同的表面活性剂来稳定和控制不同体积的分隔体积。可以使用各种方法来产生具有连续的体积分布的多个分隔体积。例如，本文的方法可以包括产生具有体积分布的多个分隔体积。在一些方面，可以在包含组合的不混溶流体的乳液中产生样品的多个分隔体积，如在本文中进一步描述的。在一个实例中，样品可以包括水溶液，所述水溶液包含目标分子(例如，核酸分子)。可以将样品与油混合以形成悬浮在油中的样品的分隔体积。根据所使用的方法，乳液中多个分隔体积的体积可以沿着连续体积分布随机分布。此外，体积范围可以通过用于形成乳液的方法来控制。例如，可以控制涡旋、振摇、超声和/或挤出的强度以产生期望的体积分布，或者通过改变表面活性剂和/或油的组成。通过使用t形连接或流动聚焦装置可以实现恒定体积的分隔体积的微流体产生。在这些系统中，分隔体积的尺寸可以通过剪切速率和通道尺寸来控制。如果对于给定的t形连接几何形状，剪切速率连续变化，则可以产生不同体积的分隔体积。这些方法可以例如通过计算机控制的注射泵或调节的气压来实现，所述计算机控制的注射泵或调节的气压调节水相和油载送流体的相对流速。数字测定可以包含多个分隔体积。在一些情况下，所述多个分隔体积可以包含2、3、4、5、6、10、100、200、250、300、384、500、1000、5000、10000、20000、30000、50000、100000、200000、300000、400000、500000、1000000或10000000个分隔体积。数字测定中分隔体积的数量也可以是2至约96、约100至约5000、约5000至约15000、约15000至约30000、约30000至约50000、约50000至约100000、约100000至约500000、约500000至约1000000、约1000000至约10000000或大于10000000个分隔体积。如本文进一步所述的，可以通过各种方式来产生和分析用于数字测量的体积。可以使用容器(例如，样品保持器)来保持分隔体积，从而可以进一步处理和/或分析分隔体积的内容物。容器可以包括试管、微量离心管、标准多孔板中的孔阵列、微阵列上或微流体芯片中的孔或腔室阵列、配置成产生分隔体积的微流体芯片以及其他能够保持样品的离散体积的装置(例如孔、腔室或管)。在一些方面，通过在容器(例如，试管)中乳化可以随机地产生各种尺寸的分隔体积，或通过在微流体装置中挤出可以半随机地产生各种尺寸的分隔体积。在两种或更多种不混溶的流体之间会产生分隔体积的乳液。如本文所使用的，术语“不混溶的流体”是指在给定的一组实验条件下，即使当彼此物理接触时也不经历明显程度的混合或共混以形成均匀混合物的两种或更多种流体。分隔体积随机性(或半随机性)可以通过减少或消除控制分隔体积尺寸所需的工作来简化数字测定。在乳化期间，可以通过使用任何合适的表面活性剂来稳定不同体积的分隔体积。乳化方法之所以特别有用是由于以下几个原因：(1)该方法与每个生物医学实验室中存在的基本仪器兼容；(2)分隔体积的产生简单；不需要复杂的芯片设计或精细的设备用于流动控制；(3)分隔体积不一定需要限制在单个孔或腔室中，这样可以最小化容纳大量分隔体积所需的空间，以及(4)该测定可以简单，因为同一容器可以在扩增过程中用于分隔体积的产生和分隔体积的储存。有利地，使用该方法，不需要在分隔体积产生和扩增反应之间的样品转移。本发明的一些方面包括在不混溶的流体中产生分隔体积。如本领域中众所周知的，可以将多种不混溶的流体组合以产生不同体积的分隔体积。如本文进一步描述的，可以通过多种方式，例如通过乳化，将流体组合。例如，可以将水溶液(例如水)与非水流体(例如油)组合，以在诸如微流体芯片的容器中产生分隔体积。适合用于本发明的水溶液可包括水基溶液，其还可包含缓冲液、盐和通常已知用于检测测定(例如pcr)的其他组分。因此，本文所述的水溶液可以包含例如引物、核苷酸和探针。合适的非水流体可以包括但不限于有机相流体，如矿物油(例如，轻质矿物油)、硅油、氟化油或流体(例如，氟化醇或fluorinert)、其他市售材料(例如tegosoft)、聚丁烯或其组合。可以以各种方式产生乳液。根据本发明的某些方面，可以通过搅拌来产生乳液，所述搅拌通常是物理搅拌。用于乳液产生的一些物理搅拌方法尤其包括但不限于振摇、涡旋(可以包括涡旋单个管或整个孔板或其他装置)、超声处理、与磁体混合、快速吸移或一些其他挤出方法，或通过微流体装置内的流动聚焦。根据本发明使用的搅拌可以是足以产生乳液的任何合适的搅拌方式。例如，可以容易地调节用于涡旋、超声处理、吸移、挤出或其他搅拌方法的速度、程度和时间，使得足以产生本发明的乳液系统。乳液的特殊特征可以通过调节系统中的化学组分和系统经受的搅拌条件来调节。也可以通过挤出，例如通过微结构的开口产生乳液。在一些方面，分隔体积包含多种乳液。在某些方面，通过组合三种或更多种不混溶的流体来制备多种乳液。可以使用各种流体或液体来制备根据本发明的乳液。在一些方面，该系统包含两种或更多种不混溶的流体，当在适当的条件下混合时，它们分成分散的分隔体积相和连续载体相。例如，将成为分散的分隔体积相的第一流体可以包含样品。在一些方面，该第一流体将是水溶液。在一些方面，该第一流体将仍然是液体，在其他方面，它可以是或变成凝胶或固体。可以用作分隔体积乳液的一个相的可能的水性流体尤其包括但不限于各种pcr和rt-pcr溶液，等温扩增溶液，如用于lamp或nasba的等温扩增溶液，血液样品，血浆样品，血清样品，含有细胞裂解物或分泌物或细菌裂解物或分泌物的溶液，以及其他含有蛋白、细菌、病毒颗粒和/或细胞(真核、原核或其颗粒)的生物样品。在某些方面，水性流体还可以包含表面活性剂或其他试剂，以促进与不混溶的流体和/或它们可能接触的其他材料或界面的期望的相互作用和/或相容性。在某些方面，负载到装置上的水溶液可以具有表达恶性表型的细胞，胎儿细胞，循环内皮细胞，肿瘤细胞，被病毒感染的细胞，被目标基因转染的细胞，或存在于患有自身免疫或自身反应性障碍的受试者的外周血中的t细胞或b细胞，或其他亚型的免疫细胞，或在外周血或淋巴系统或脊髓液或其他体液中循环的稀有细胞或生物颗粒(例如，外泌体、线粒体)。在一些情况下，细胞或生物颗粒在样品中可能很少见，离散化可以用于例如在空间上隔离细胞，从而实现稀有细胞或生物学颗粒的检测。在一些方面，将变成连续相的第二流体将是与第一流体不混溶的流体。第二流体有时被称为油，但是不必然是油。可以用作第二流体的可能的流体包括但不限于基于碳氟化合物的油，基于硅化合物的油，基于烃的油，如矿物油和十六烷，聚丁烯，基于植物的油，离子液体，与第一水相不混溶或与第一相形成物理屏障的水相，超临界流体，空气或其他气相。在本发明的某些方面，分隔体积可以包含流体界面改性。流体界面改性成分包括界面稳定或改性分子，例如但不限于表面活性剂、脂质、磷脂、糖脂、蛋白、肽、纳米颗粒、聚合物、沉淀剂、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子或其他组分。在一些方面，一种或多种流体界面改性成分可以存在于将要包含在分散的分隔体积相流体中的流体中。在其他方面，一种或多种流体界面改性成分可以存在于将要包含在连续载体相流体中的流体中。在又其他方面，一种或多种流体界面改性成分可以存在于分散的分隔体积相流体和连续的载体相流体二者中。将要包含在乳液的一个相中的流体中存在的流体界面改性成分可以与将要包含在乳液的另一个相中的流体中存在的流体界面改性成分相同或不同。在本发明的一些方面，流体界面改性成分可以用于防止相邻的乳液分隔体积的聚结，实现长期的乳液稳定性。在一些方面，流体界面改性成分可以具有一些其他或另外的重要作用，例如在分隔体积内提供生物相容性表面，其还可以或不可以有助于乳液稳定性。在一些方面，组分可以在控制流体之间或分隔体积之间的组分的输送中发挥作用。流体界面改性成分的一些非限制性实例尤其包括但不限于abilwe09、abilem90、tegosoftdec、牛血清白蛋白(bsa)、脱水山梨糖醇(例如span80)、聚山梨酸酯(例如peg化脱水山梨糖醇，如tween20和tween80)、十二烷基硫酸钠(sds)、1h,1h,2h,2h-全氟辛醇(pfo)、triton-x100、单油酸甘油酯(monolein)、油酸、磷脂和pico-surf以及各种氟化表面活性剂等。在一些方面，乳液系统将由分散的水相组成，该水相包含目标样品，并被连续的油相包围。其他方面可以是该系统的变化或修改，或者它们可以是组成或构造完全不同的乳液。供选择的乳液系统包括多重乳液，例如水包油包水(水/油/水或w/o/w)乳液，或油包水包油(油/水/油或o/w/o)乳液。那么这些多重乳液系统将具有内相、中间相和外相。在一些方面，内相和外相可以具有相同的组成。在其他方面，内相和外相可以是相似的，例如均为水相或均为相同的油，但是具有不同的子组分。在其他方面，所有三个乳液相可以具有不同的，有时非常不同的组成。在某些方面，乳液系统可以包含两种不混溶流体，其均为水性的或均为非水性的。在另外的方面，两种乳液流体可以是基于油的，其中油彼此不混溶。例如，一种油可以是基于烃的油，而另一种油可以是基于碳氟化合物的油。在其他乳液系统中，两种流体可以主要是水性的，但彼此仍然不混溶。在一些方面，这在水溶液包含彼此相分离的组分时发生。可以使用的溶质的一些实例包括但不限于包含以下的系统：葡聚糖、聚蔗糖、甲基纤维素、不同长度的聚乙二醇(peg)、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、repalpes、k3po4、柠檬酸钠、硫酸钠、na2hpo4和k3po4。除了水溶液和非水流体之外，还可以包括表面活性剂，以例如改善分隔体积的稳定性和/或促进分隔体积形成。合适的表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂、离子表面活性剂、基于硅氧烷的表面活性剂、氟化表面活性剂或其组合。非离子表面活性剂可以包括，例如，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(span60)、辛基苯氧基乙氧基乙醇(tritonx-100)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(tween80)和脱水山梨糖醇单油酸酯(span80)。基于硅氧烷的表面活性剂可以包括例如abilwe09表面活性剂。可以类似地使用本领域通常公知的其他类型的表面活性剂。在一些方面，表面活性剂可以以各种浓度或浓度范围存在，例如按重量计约0.01％、0.1％、0.25％、0.5％、1％、5％或10％。根据本发明的某些方面，可以在芯片中形成并测定分隔体积。根据另外的方面，扩增和数字测量可以在数字化芯片中进行。根据一个示例性方面，本发明提供了不同尺寸的分隔体积的阵列，其中图案化的表面用于建立不同尺寸的体积的阵列。根据该方面，产生了七组阵列，其中每个阵列包含900个分隔体积(30×30)。通过在疏水性表面的背景中产生亲水性圆形斑点来形成阵列。因此，当表面暴露于水溶液和油时，被油包围的水滴将覆盖亲水性斑点。分隔体积可以是半球形，但是形状可以根据我们正在使用的表面以及使用的油和水溶液改变(更扁平或更圆)。一方面，使用重油，并且由于油会推动液滴，因此液滴更扁平。限定每组900个亲水性斑点的圆圈具有不同的尺寸，范围从直径1μm到5μm到10μm到50μm到100μm到500μm，最后到直径1mm。因为液滴的体积与液滴的直径的立方大致成比例，所以使斑点的直径增加十倍使体积增加约1000倍。因此，与简单地使用更多相同尺寸的分隔体积相比，使用不同尺寸的分隔体积在空间和读出方面更有效。一方面，每组阵列使用900个分隔体积，因为该数量适合实现统计上稳健的数字读出。然而，根据具体应用和所需的读数稳健性，可以在每组阵列内设计更多的分隔体积或更少的分隔体积。根据该方面，由于容易对不同尺寸的亲水性斑点进行表面图案化，因此可以产生具有不同尺寸的分隔体积的大阵列。该方面对于其中通常希望宽的动态范围的应用，如数字pcr可以是有用的，在使用图案化表面产生的液滴中进行pcr是非常有益的。用于进行数字测量的装置和方法本发明的另一方面包括用于进行本发明的方法的装置。根据该方面，本发明提供了用于产生具有体积分布的多个分隔体积的装置，用于测量所述多个分隔体积中的给定的分隔体积的体积的装置，用于确定分隔体积中的样品的存在或不存在以及多个分隔体积中的样品的浓度的装置。本方法能够实现在较大的动态范围上进行数字测量，以及能够增加动态范围的方法和系统。具体地，该装置特别是通过建立不同尺寸的样品体积来增加样品的数字测量的动态范围。在一些方面，本发明的方法在多个分隔体积上同时进行。在另外的方面，多个分隔体积包括分隔体积的阵列。在还另外方面，分隔体积的阵列布置在多孔板中。在一些方面，在至少三个数量级的动态范围内或在至少六个数量级的动态范围内确定可检测试剂的浓度。在一些方面，多个分隔体积包含第一流体和第二流体，其中第一流体与第二流体不混溶。在某些方面，通过搅动包含第一流体和第二流体的溶液来形成分隔体积的乳液，其中第一流体与第二流体不混溶。在另外的方面，所述搅动包括涡旋。在各个方面，本发明提供了包括以下步骤的方法：通过搅动包含第一流体和第二流体的溶液形成分隔体积的乳液，其中第一流体与第二流体不混溶；在第三流体中搅动所述乳液，其中第三流体与第二流体不混溶，从而形成复乳。在一些方面，本发明提供了包括流体搅动的方法，其中搅动可以是振摇、涡旋、超声处理、与磁体混合、挤出、通过流动聚焦或其组合。在另外的方面，搅动足以形成乳液。在另外的方面，挤出包括吸移流体，其中所述吸移足以产生乳液。在某些方面，搅动发生在微流体装置中。在各个方面，第一流体包含水，第二流体包含油，并且第三流体包含水。在各个方面，分隔体积包含多种乳液。在另外的方面，通过组合三种或更多种不混溶的流体来制备多种乳液。在一些方面，第一流体是水性的。在某些方面，第一流体包含样品。在另外的方面，第二流体是油。在某些方面，第二流体是油，并且第二流体与第一流体和第三流体不混溶。在一些方面，第一流体不同于第三流体。在某些方面，第三流体是油，并且其中第三流体与第一流体和第二流体不混溶。在一些方面，乳液包含水相和非水相。在另外的方面，第一流体包括水，第二流体包括油。在某些方面，多个分隔体积还包括流体界面改性成分。在另外的方面，流体界面改性成分是表面活性剂。在又另外的方面，流体界面改性成分选自脂质、磷脂、糖脂、蛋白、肽、纳米颗粒、聚合物、沉淀剂、微粒、具有疏水部分和亲水部分的分子或其组合。在一些方面，本发明的方法还包括将一种或多种不混溶的流体转化成凝胶或固体。在某些方面，在扩增样品之前、在扩增样品期间或在扩增样品之后，将不混溶的流体转化成凝胶或固体。如本文所使用的，术语“动态范围”被定义为可改变的量的最大和最小可能值之间的比率。术语“数字测定”是指在其中基于较小的测量值的计数进行测量的测定，其中每个较小的测量值都是二进制的，其值恰好为可分配给它的两个可能值之一。本文所述的数字测定包括基于从流体的单个体积获得的二进制测量值的计数来测量流体中存在的样品。可以在分析体积之前或期间，在具有不同尺寸的体积中进行反应(例如，扩增)，以确定哪些体积已经经历反应(例如，具有扩增产物)。在某些实例中，可以确定体积(例如，分隔体积)的尺寸，并对占据的分隔体积(例如，包含可检测试剂的分隔体积)的数量进行计数。可以分析全部或仅一些分隔体积。例如，可以通过使分隔体积以单行形式流动通过流式细胞仪或类似装置来实现分析，在该装置中可以确定分隔体积的尺寸并可以检测扩增的存在。分隔体积的尺寸例如可以基于来自分隔体积的散射信号来确定，并且扩增的存在可以通过来自分隔体积的荧光信号来指示。供选择地，可以通过显微镜确定分隔体积的直径。可以从容器(例如样品保持器)提取(在反应，例如扩增之前、期间或完成之后)分隔体积，并用ccd相机以宽视野成像。例如，分隔体积可以散布在表面上或嵌入两个载玻片之间，并置于宽视野显微镜下。通过使用适宜的激发和发射滤波器，可以量化分隔体积内的荧光，以显示扩增的存在或不存在。通过注意分隔体积的尺寸以及每个分隔体积中扩增产物的存在或不存在，可以在询问足够数量的不同尺寸的分隔体积后，反算样品中存在的分析物的原始浓度。因为分隔体积的尺寸不同，所以对于给定的动态范围，分析要比分隔体积都具有相似尺寸的情况快得多。在一些方面，本文的方法还包括使用多个分隔体积中的分隔体积的数量和多个分隔体积中的分隔体积的单个体积来进行数字测量。例如，可以使用多个分隔体积中的分隔体积的数量，多个分隔体积中具有一个或多个目标分子的分隔体积的数量，以及通过测量多个分隔体积中的分隔体积中的一些或全部的体积来确定目标分子的样品浓度。在一些方面，本发明提供了用于进行数字测定的方法，包括：产生多个分隔体积，其中至少一些分隔体积包含样品；扩增样品；用可检测试剂标记样品；使多个分隔体积流动通过流式细胞仪通道；在其流动通过流式细胞仪通道时确定分隔体积的体积；确定分隔体积中可检测试剂的存在或不存在；和基于在多个分隔体积中可检测试剂的存在或不存在，确定多个分隔体积中样品的浓度。在某些方面，确定样品的浓度包括检测从分隔体积散射的光。本发明可以用于其中数字测量提供关于样品的有用信息的任何技术。因此，本文提供的方法、系统和装置可以包括包含可检测试剂的体积。在某些方面，该体积可以是微流体芯片中的孔或腔室，或者是包含可检测试剂的分隔体积(例如，在乳剂中或在芯片表面上形成的水分隔体积)。通常将理解，可检测试剂可以包括单个可检测分子或多个可检测分子。可以使用其他类型的可检测试剂，例如，珠、量子点、纳米颗粒等。此外，可检测试剂可以是例如存在于待分析样品中的目标分子(例如，血液、血清、唾液或其他溶液中的核酸分子)。供选择地，可检测试剂可以是与样品中的目标分子(例如，核酸分子)关联，从而使该分子可以被检测的分子。在一些方面，本发明的方法和系统可以用于涉及数字测量的扩增相关技术(例如，数字pcr)。对于扩增测量，体积(例如，分隔体积)可以包括例如单一dna分子，但是该体积还将包含通常众所周知的用于扩增和检测的必要组分。在一些方面，可检测试剂是荧光的，因此可以通过本领域已知的基于荧光的检测方法来检测。然而，可以使用其他检测方法(例如吸光度、化学发光、浊度和/或散射)来分析体积的内容物。适合本发明的各种可检测试剂在本领域中通常是众所周知的，并且可以例如在分子探针手册(themolecularprobeshandbook)，第11版(2010)中找到。在一些方面，本发明的方法包括仅在分隔体积包含样品的情况下测量分隔体积的体积。在另外的方面，所述方法包括从测量值排除确定为不包含样品的任何分隔体积。在一些方面，根据本文公开的方法，通过仅对那些被确定为包含样品的分隔体积进行确定、定尺寸或列举，来确定样品浓度。在一些方面，通过测量或知晓样品的总体积，并通过仅对那些被确定为包含样品的分隔体积进行确定、定尺寸或列举，确定样品浓度。在另外的方面，通过测量或知晓样品的总体积，以及通过列举所有阳性的分隔室体积并确定每个阳性分隔体积的体积，来确定样品中分析物的浓度。该方法的优点包括减少扫描的分隔体积的数量，从而减少用于确定样品浓度的分析时间。如本文中进一步描述的，本发明提供了现有方法和系统无法实现的数字测量的各个方面。例如，本发明可以提供在宽动态范围内测量样品浓度的能力。在一些方面，动态范围可以是至少三个数量级、至少四个数量级、至少五个数量级或至少六个数量级。在一些方面，动态范围可以为约10至1010个分子/ml、约102至107个分子/ml、约104至1010个分子/ml、约105至109个分子/ml。在某些方面，可以通过检测与样品中的目标分子关联的可检测试剂来进行动态范围内的样品浓度确定。动态范围可以取决于各种因素，例如乳液中产生的体积范围和/或分析和检测的体积范围。在某些方面，体积分布包括连续变化的分隔体积尺寸。在一些方面，在芯片上使用浓度梯度进行本发明的方法。通过将dpcr与芯片上梯度产生整合，或通过使用不同尺寸的分隔体积，或这两种方法的组合，本发明有效地将我们的dpcr芯片的动态范围提高了一个数量级至六个数量级，这与rt-pcr提供的动态范围相当。通过使用更大范围的浓度梯度或具有更大尺寸差异的分隔体积阵列，可以根据需要甚至进一步增加动态范围。与现有技术相比，这种进行定量pcr(qpcr)的方法提供几个主要优点：(1)其更准确；(2)其排除对运行rt-pcr所需的校准样品类型的需求，因此通量更高；和(3)其消除对实时灵敏的荧光检测的需求，该实时灵敏的荧光检测是rt-pcr与标准pcr装置相比成本相对较高(～10x)的原因。本发明的另一方面包括用于进行本发明的方法的装置，其中所述装置建立不同尺寸的数字化和离散体积的阵列。另一方面，所述装置进行用于增加样品的数字测量的动态范围的方法，包括建立样品浓度梯度和建立不同尺寸的样品体积。在一些方面，本发明提供了用于使用数字测量来确定样品浓度的方法。该方法可以包括产生具有体积分布的多个分隔体积，其中多个分隔体积中的至少一个分隔体积包含来自样品的内容物；确定分隔体积的体积；确定分隔体积中样品的存在或不存在；和使用发现包含可检测试剂的分隔体积的体积和分隔体积的数量来确定样品的浓度。在一些方面，本发明包括增加数字测量的动态范围的方法，所述方法基于建立各种尺寸(即体积)的数字化和离散体积的阵列。该方法比简单地增加分隔体积的数量以增加动态范围更好。这是因为简单地增加分隔体积的数量增加体积占据的面积，以及增加芯片上具有缺陷的可能性，其中一些分隔体积无法正确形成或具有其他缺陷。简单地增加分隔体积的数量也由于增加分析所有分隔体积所需的时间而降低通量。在某些方面，可以通过建立不同尺寸的分隔体积的阵列而不是简单地增加分隔体积的数量，来增加动态范围。不同尺寸的分隔体积的阵列可以是随机阵列(例如，直径不同的分隔体积全部存在并随机分布在容器中)或可以是规则阵列。在某些方面，分隔体积随后可以单行形式流动通过流式细胞仪或其他类似装置，在其中可以确定分隔体积的尺寸并且可以询问来自分隔体积的荧光。当使用流式细胞术或其他流通方法时，基于荧光确定每个分隔体积中扩增产物的存在，并且基于来自分隔体积的散射信号确定每个分隔体积的尺寸(体积)。供选择地，可以通过以与基于图像的流式细胞术相似的方式在分隔体积通过设备时拍摄图像来确定尺寸。以这种方式，通过注意每个分隔体积的尺寸以及给定尺寸的每个分隔体积中扩增产物的存在或不存在，可以在询问足够数量的不同尺寸的分隔体积后反算样品中存在的分析物的原始浓度。由于分隔体积的尺寸不同，因此出于前面讨论的原因，对于给定的动态范围，分析比分隔体积都具有相似尺寸的情况要快得多。此外，可以通过搅动包含第一流体和第二流体的溶液来形成分隔体积的乳液。第一流体可以与第二流体不混溶。并且，可以在第三流体中搅动乳液。第三流体可以与第二流体不混溶，从而形成复乳。第一流体可以包含水，第二流体可以包含油，并且第三流体可以包含水。可以以多种方式搅动(多种)流体，例如通过振摇、涡旋、超声处理、与磁体混合、挤出、流动聚焦或其组合。搅动可以足以形成乳液。挤出例如可以包括吸移流体，其中吸移足以产生乳液。搅动可以在微流体装置中发生。乳液可以包含水相和非水相。分隔体积可以包含多种乳液。分隔体积可以包含多种乳液。可以通过组合三种或更多种不混溶的流体来制备多种乳液。三种或更多种不混溶的流体可以包括第一流体、第二流体和第三流体。第一流体可以是水性的。第二流体可以包含油。第二流体可以与第一流体和第三流体不混溶。不混溶的(多种)第一、第二和/或第三流体可以转化为凝胶或固体。第一流体可以不同于第三流体。第三流体可以包含油。第三流体可以与第一流体和第二流体不混溶。不混溶的第三流体可以转化为固体或凝胶。第一流体可以包含用于检测的样品。第一流体的折射率可以与第二流体的折射率相差小于200％、小于100％、小于60％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。本发明的系统还包括检测系统，该检测系统被配置成分析多个分隔体积中的体积以及多个分隔体积中的样品的存在或不存在。检测系统可以包括用于分析体积的内容物、确定分隔体积的体积和/或其他目标特征的检测器。本文所述的方法通常将与能够检测和分析体积(例如，分隔体积和/或孔)的任何已知系统兼容。数字测定系统本文所述的系统可包括包含多个分隔体积的容器(例如，样品保持器)，包含在多个分隔体积中的至少一个分隔体积中的样品、靶分子、编码颗粒或指示剂，或包括存储装置的计算机。任选地，该系统还可以包括检测器，用于检测分隔体积的尺寸(即，分隔体积的体积)。用于进行数字测定的系统还可以包括加热元件，该加热元件被配置成将热能施加到一个或多个分隔体积。数字测定的样品如本文所使用的，样品可以是数字测定的组分。可以将样品或其部分等分、分开或以其他方式分成分隔体积(例如，数字化体积)。样品可以包含均质溶液或非均质混合物。样品可以包含来自受试者(例如动物、植物或单细胞生物)的组织、细胞、流体、靶分子或其组合。例如，样品可以包含血液、血清、血浆、尿液、粪便、淋巴液、唾液或脑脊髓液。在一些情况下，可以对样品进行处理(例如，过滤、纯化、均质化、浓缩、稀释或分隔)或增强(例如，通过添加其他试剂，例如分子、酶、猝灭剂、探针、内标、可检测试剂或扩增试剂)。样品可以包含一个或多个靶分子(例如，多个靶分子、目标分子或分析物等)。样品还可以包含多于一种类型的靶分子(例如，多于一种独特靶分子、多于一个种类的靶分子或多于一组靶分子)、多个类型的靶分子(例如，多种独特靶分子、多个种类的靶分子物质或多组靶分子)。在一些情况下，样品可以不包含靶分子。靶分子的非限制性实例包括多肽、多核苷酸(例如，基因组dna，互补dna，重组dna，无细胞dna，寡核苷酸，rna分子，例如信使rna、核糖体rna、转运rna、非编码rna、小核rna、小核仁rna、向导rna、微小rna，crisprrna，piwi相互作用rna、小干扰rna、病毒rna或其片段)、细胞、稀有细胞、细胞部分、细胞器、病毒、药物、毒素、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸、代谢物或其片段或衍生物。样品可以被扩增。样品的分子(例如靶分子)可以用可检测试剂例如编码颗粒或其他发色团标记。样品或其部分可以缺少靶分子或靶分子的类型(例如，样品的部分可以缺少多个独特分子中的一个或多个独特分子)。可以将样品等分、划分或以其他方式分离到分隔体积中，以使一个分隔体积或多个分隔体积包含样品的部分，但不包含在将样品分离到分隔体积之前在样品中存在的靶分子。在一些情况下，整个样品缺少靶分子。例如，样品可以包含空白样品(例如对照样品)。空白样品可以是与患者样品具有相同的化学或物理特性但缺少患者样品中存在的靶分子的流体。在一些方面，靶分子可以是多肽、多核苷酸、细胞、病毒、小分子、药物、毒素、碳水化合物、糖、脂质或脂肪酸。在一些方面，靶分子可以是多肽，例如蛋白，并且探针的结合区可以被配置成与靶分子结合或杂交。在其他方面，靶分子可以是目标生物素化蛋白，并且探针的结合区是与生物素化蛋白特异性结合的亲和素(例如，链霉亲和素)。分隔体积的容器分隔体积可以位于容器中。容器可以包括能够将分隔体积保持为离散体积的容器。所述容器可以被配置成用于保持分隔体积或多个分隔体积(例如，在检测可检测信号或代码的过程中)。例如，容器可以包括试管、样品管、毛细管、移液器或移液头、多孔板(例如微量滴定板)的孔或自数字化芯片(可以是微流体芯片)中的腔室。在一些情况下，容器包含多个分隔体积。例如，自数字化芯片或微流体芯片可以包括多个腔室，其中每个腔室可以包含分隔体积。多孔板也可以包括多个孔，其中每个孔可以包含分隔体积。管、通道或一段管道可以包含通过例如疏水力分离的多个分隔体积。在一些方面，容器可以包括芯片，或包括芯片的区域，例如芯片中的腔室。芯片可以包括自数字化芯片。可以用于本文所述的方法和系统的容器的实例，例如自数字化芯片，可以在wo2012/100198中找到，其通过引用整体并入。温度控制装置本发明的方法和系统可以包括温度控制设备(其可以包括温度控制装置)，用于调节在本文所述的方法和系统中使用的分隔体积和/或任何分子或试剂的温度。因此，通过限定目标温度或温度设定点，可以将控制的(例如，调节的)温度施加到分隔体积和/或其内容物。通过控制分隔体积(例如细胞、分子或可检测试剂)的温度，可以改进或优化扩增的程度和效率(例如包括核酸合成、延伸、退火或解链的数字方法的任何步骤或过程)。在一些实施方案中，例如，可以使用多个温度控制装置来改善跨数字测定的单个分隔体积(例如，容器如多孔板或微流体芯片的孔或腔室)的温度均匀性。温度控制装置可用于保持样品、组、测定和实验之间的实验条件一致。通过在扩增或延伸过程期间升高分隔体积或其中包含的分子的温度，可以引起、调节或停止分隔体积中分子的扩增或延伸。温度控制装置可以包括加热元件，该加热元件用于升高分隔体积中或周围的温度。加热元件可包括电加热元件、对流加热元件、空气加热元件，珀尔帖加热元件、电阻加热元件、燃烧加热元件、感应加热元件(可用于包括感应线圈等的容器)、化学加热元件或光加热元件(例如红外光)。可以基于以下选择加热元件机制：附近产生的对施加电压或电场的影响，在几乎没有变化或噪音或没有变化或噪音的情况下精确和准确地在分隔体积(或其内容物)中诱导规定的温度的能力，和关于给定应用的适用性的考虑。温度控制装置还可以包括冷却元件，用于降低分隔体积(或其内容物)周围的温度。冷却元件例如可以包括珀耳帖装置。温度控制装置可以包括能够随时间改变温度的系统。可以(手动或数字式)规定温度控制装置或多个温度控制装置以随着时间独立地或配合其他实验条件改变分隔体积、分隔体积的部分(或其内容物)、容器或容器的部分的温度。以这种方式，分隔体积或其内容物(例如探针或靶分子)的加热和/或冷却可以是周期性的。温度控制装置还可以包括散热器或冷却元件，例如制冷单元。温度控制装置可包括热电偶和/或珀耳帖热泵。通过将温度控制装置(其可以包括升高温度的装置、检测温度的装置和/或降低温度的装置)加入到容器中，或将温度控制装置放置在分隔体积附近，或通过控制容器或分隔体积周围的温度，可以(例如，手动地或通过计算机处理器可执行的程序)使用温度控制装置控制分隔体积或其内容物(例如探针或靶分子)的温度。通过计算机处理器的控制反馈回路，诸如热电偶的温度检测元件和加热元件或冷却元件，可以控制分隔体积或其内容物的温度，其变化不超过0.25℃、不超过0.5℃、不超过0.75℃、不超过1℃、不超过2℃、不超过3℃、不超过4℃或不超过5℃，所述温度可以相对于温度设定点进行测量。温度设定点可以是将要在其下进行实验(例如，如本文所述的扩增或延伸)的目标温度。温度设定点可以由存储在计算机存储器中的编程协议指定，其也可以由用户手动指定(例如，通过诸如触摸屏或键盘的输入接口)。如本文所述的用于进行数字测定的系统可以包括能够调节多个分隔体积中的至少一个分隔体积的温度的加热元件。如本文所述，用于进行数字测定的系统可以包括能够单独地或串联地加热多个分隔体积或其部分的加热元件。加热元件可以用于涉及热循环方法的数字测定中，其中可以将分隔体积的温度升高或降低至目标温度或按顺序的一系列预选温度。在一些情况下，加热元件可以以离散的温度阶跃将热能施加到一个或多个分隔体积。加热元件也可以配置成以随时间增加的速率将热能施加到分隔体积。在一些情况下，数字测定系统的加热元件可以将热能串联地施加到多个分隔体积。加热元件也可以用于等温数字测定方法，其中将多个分隔体积(或其部分)的温度升高至目标温度并保持在该温度。例如，加热元件可以用于使分隔体积的温度升高或降低到以下温度，或将分隔体积的温度保持在以下温度：约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃、约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃、约93℃、约94℃、约95℃、约96℃、约970℃或在由这些值中的任何两个限定的范围内。在一些情况下，加热元件能够单独地或成组地将多个分隔体积加热到多个目标温度。在一些情况下，加热元件可以构造成跨多个分隔体积，例如在分隔体积的阵列中提供连续的温度梯度。成像源成像源可以包括本文所述的任何成像装置和来源。成像源可以包括例如光学成像源。成像源可以被配置成进行以下一种或多种：共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、贝塞尔光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、表面荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明或其组合。本文所述的系统和方法可以包括用于成像或检测编码颗粒或分子的辐射源。辐射源可以包括任何波长的辐射源，例如可见光、红外光、紫外光、微波或x射线(用于x射线衍射)。在一些情况下，数字测定中使用的辐射源可以用于激发荧光团或发色团。通过刺激分隔体积的内容物(例如探针、编码颗粒、染料、荧光团、发色团、指示剂、靶分子等)，可以产生可检测代码或信号，然后使用其为分隔体积分配数字值。在某些方面，电磁辐射源包括激光、灯、led或其组合。在一些方面，所述系统还包括光谱滤波器、多色镜(multichroicmirror)或其组合。在一些方面，检测器包括显微镜。在一些方面，检测器包括照相机。在一些方面，检测器包括流式细胞仪。在一些方面，处理器可以基于所测量的发射性质将分析物引导至流式细胞仪或微流体装置的流动池。在一些方面，所述系统包含多种不同的分析物，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的分析物。在一些方面，所述系统包括多个不同的编码的发色团聚合物颗粒，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同的编码的发色团聚合物颗粒，例如其连接到两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同的生物分子，所述生物分子各自对两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的分析物具有结合亲和力。在一些方面，所述系统提供了电磁辐射源，所述电磁辐射源被配置成充当含有编码发色团聚合物颗粒的悬浮液和样品的激发源。在一些方面，电磁辐射源包括激光。在一些方面，由激光发射的峰值波长为约200nm至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm或约900nm至约1000nm。在一些方面，可以使用具有独特峰值波长的两种或更多种激光。在一些方面，电磁辐射源包括发光二极管(led)。led是半导体光源。在一些方面，当led的阳极引线的电压比其阴极引线的电压的正值大至少led的正向电压降时，电流流动。电子能够与装置内的空穴复合，以光子的形式释放能量。光的颜色(对应于光子的能量)由半导体的能带隙决定。在一些方面，led发射的峰值波长为约200纳米至约300nm、约250nm至约350nm、约300nm至约400nm、约350nm至约450nm、约400nm至约500nm、约450nm至约550nm、约500nm至约600nm、约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm、约700nm至约800nm、约750nm至约850nm、约800nm至约900nm、约850nm至约950nm或约900nm至约1000nm。在一些方面，可以使用具有独特峰值波长的两个或更多个led。检测系统如本文中所讨论的，本发明包括配置成分析多个分隔体积中的分隔体积中的体积以及靶分子的存在或不存在的检测系统。该检测系统可以包括配置成由用户操作的计算装置，配置成由所述计算装置操作的成像源，以及配置成由成像平台或成像源成像并且可以包含要成像和分析的分隔体积系统或乳液系统的多孔板。所述检测系统可以包括配置成由用户操作的计算装置，配置成由所述计算设备操作的成像源，以及配置成由所述成像平台或成像源成像并且可以包含要成像和分析的分隔体积系统或乳液系统的微流体芯片。在本发明的一些方面，通过特定波长范围内荧光的增加来指示在分隔体积内的一个或多个靶分子的存在。在一些方面，pcr反应产物通过特定波长范围内的荧光(指示剂荧光)的增加来指示靶分子的存在。在一些方面，参考试剂可与靶分子并行使用。根据该方面，无论是否存在靶分子，分隔体积都在与靶分子的波长范围不同的波长范围内发射荧光(即参考荧光)。对于给定的一组分隔体积，获得指示剂荧光和参考荧光的分开的几组图像，并确定和测量每组中的分隔体积。可以比较来自给定分隔体积的指示剂荧光和参考荧光。在一些方面，指示剂荧光与参考荧光的比率可用于指示特定的分隔体积是否包含靶分子。在其他方面，指示剂荧光的绝对强度将足以指示分隔体积是否包含靶标。在一些方面，可以在比较指示剂的荧光强度和参考强度之前，从分隔体积内的像素强度扣除背景像素的平均值或其倍数。通过进行该分析，可以获得分隔体积直径的列表，并且对于每个测量的分隔体积，均获得了确定分隔体积是否被占据(包含一个或多个靶分子)的二进制测量值。然后，可以使用分隔体积尺寸的列表和所占据的分隔体积的总数来获得样品的目标浓度。在应用本发明的方法的同时，有许多可能的方式来测量乳液中的分隔体积的尺寸、含量和/或其他方面。在一些方面，可以通过包括流式细胞仪的光学检测器以光学方式测量分隔体积。根据该方面，分隔体积可以流动通过大的流动通道，在其中分隔体积的形状不被扭曲，并且当分隔体积经过光激发源时，可以通过计算机软件基于光学探测器(例如光电倍增管)获取的光散射图样的测量值来确定其体积。在其他方面，分隔体积可以穿过狭窄的流动通道，在其中分隔体积符合通道宽度。根据该方面，可以通过使用通道宽度和通道中单个分隔体积的长度来确定分散的分隔体积的体积，以确定其体积。根据本发明可以使用各种信号检测方法。在各个方面，本发明的方法和系统提供了使用光学检测方法和光学检测器检测分隔体积。在一些方面，可以通过包括荧光显微镜及其相关组件的光学检测器以光学方式测量乳液系统。可以使用例如共聚焦激光扫描显微镜、旋转盘(nipkow盘)共聚焦显微镜或使用可编程反射镜阵列或空间光调制器的显微镜从多个焦深获取数据来获取图像。在其他方面，可以用表面荧光显微镜获取图像。在一些方面，随后可以使用由计算机软件执行的3d去卷积算法来处理采用表面荧光显微镜获取的图像。在其他方面，可以使用多光子显微镜，例如双光子显微镜来获取图像。在其他方面，可以使用平面照明显微镜、贝塞尔光束显微镜、微分干涉差显微镜、相差显微镜、明场成像、暗场成像或倾斜照明来获取图像。在一些方面，可以使用本文列出的成像装置和方法的组合或可以合理地应用于本方法的任何其他合适的成像装置和方法来获取图像。数字测定系统的检测器可以被配置成检测分隔体积或其内容物的各个方面。例如，检测器可以被配置成检测在分隔体积内散射的光(例如，由于被成像源或电磁辐射源激发或照射)。在一些情况下，检测器可以检测来自探针、编码颗粒或包含发色团的另一颗粒的可检测信号或代码。在一些情况下，可以将检测器配置成检测光学可检测信号或代码。在一些情况下，检测器可以被配置成检测或测量发射强度(例如，发射峰强度)、发射波长(例如，发射峰波长)、发射寿命或其组合。例如，检测器可以被配置成检测或测量选自发射强度(例如，发射峰强度)、发射波长(例如，发射峰波长)或发射寿命的可检测信号或代码的两个或更多个方面。检测器还可以配置成检测或测量可检测信号或代码的光谱强度。在一些情况下，检测可检测信号或代码的一个或多个方面(例如，发射峰强度、发射强度范围、发射峰波长、发射波长范围或光谱、发射寿命、吸收峰波长、激发峰波长和/或光谱强度)可以指示分隔体积中靶分子的存在。在一些情况下，检测可检测信号或代码可以包括检测多个发射峰强度、发射峰波长、发射寿命、吸收峰波长、激发峰波长或光谱强度。因此，检测器可以被配置成检测多个发射峰强度、发射强度范围、发射峰波长、发射波长范围或光谱、发射寿命、吸收峰波长、激发峰波长或光谱强度。在一些情况下，检测器可以被配置成测量分隔体积的各个方面。本发明的系统还包括被配置成分析由编码颗粒发射的信号的检测器和计算机。检测器可以包括用于分析信号强度、信噪比和/或其他目标特征的检测器。本文所述的方法通常将与能够检测和分析诸如图像的光学信息的任何已知系统兼容。在一些方面，该系统提供了检测由编码颗粒发射的一个或多个信号的检测器。在一些方面，检测器包括显微镜，例如共聚焦显微镜、旋转盘显微镜、多光子显微镜、平面照明显微镜、贝塞尔光束显微镜、微分干涉差显微镜、相差显微镜、表面荧光显微镜或其组合。在一些方面，检测器包括照相机，例如电荷耦合器件照相机或cmos照相机，其可以将信号整合到数字芯片上的图像中。在一些方面，检测器包括光电倍增管。在一些方面，检测器包括流式细胞仪。在一些情况下，检测器可以配置成在分隔体积流动经过检测器时测量或确定其体积。在一些方面，对检测器和电磁辐射源进行了优化以进行多路复用分析。在一些方面，检测器和电磁辐射源被配置成激发编码颗粒并快速检测发射的信号(例如，光学可检测代码)。在一些方面，检测器和电磁辐射源被配置成激发编码颗粒并在小于1纳秒、小于10纳秒、小于100纳秒、小于1微秒、小于10微秒、小于100微秒、小于1毫秒、小于10毫秒、小于100毫秒、小于1秒、小于10秒或小于100秒内检测一个或多个发射信号。在一些方面，检测器和电磁辐射源被配置成激发编码的发色团聚合物颗粒并同时检测两个或更多个发射信号。可以通过光学检测方法来检测多个分隔体积中的分隔体积的尺寸或数量。还可以使用光学检测方法进行来自分隔体积的可检测信号或代码的检测。通过检测可测量的光学性质(例如光的存在)运行的任何检测器或其组件都可以包括光学检测器。光学检测器的实例包括但不限于照相机、光电倍增管、光电二极管和光电二极管阵列，以及显微镜及其相关组件，例如物镜、滤光器、反射镜等。在某些方面，对通过光学检测器或其他合适的检测器检测到的信号进行处理，以解读检测器所测量的信号。在某些方面，通过存储和/或处理由诸如光学检测器的检测器获取的信息的装置、设备或其组件来处理测量的信息。信息处理器的实例包括但不限于存储由检测器获取的信息的个人计算装置，以及在处理该信息的个人计算装置上运行的软件。在其他方面，信息处理器或其组件可以被嵌入检测器中，例如嵌入在照相机中嵌入的芯片中，该芯片永久或临时存储由照相机获取的光学信息。在其他方面，信息处理器和检测器可以是完全集成的装置的组件，该装置获取和处理光学信息以进行数字测定。另一方面，提供了用于分析体积以检测和计算给定分隔体积的信息的系统。例如，光谱强度可以包括多个发射峰强度或发射强度范围，发射峰波长或发射波长范围或光谱的比率，并且用于数字测定的系统能够计算多个发射峰强度或强度范围，发射峰波长或发射波长范围或光谱的比率。该系统可以包括一个或多个处理器，以及包括一个或多个处理器可执行的指令的存储设备。当由一个或多个处理器执行指令时，所述系统至少可以接收用户输入以分析体积(例如，多个分隔体积)。指令可使处理器操作检测器以测量可检测信号或代码，以(例如，在非临时存储器中)存储所测量的可检测信号或代码，和/或以分析所测量的可检测信号或代码。该系统可以被配置成实施本发明的方法的多方面，例如计数体积(例如，分隔体积)的数量，确定体积分布中的多个分隔体积的体积，以及使用含有一种或多种可检测试剂的分隔体积的数量来确定样品中可检测试剂的浓度。该系统还可以向用户提供数据。向用户提供的数据可以包括样品中可检测试剂的浓度或样品浓度。图像分析在各个方面中，本发明提供了许多用于确定、选择或分析(例如，确定分隔体积的尺寸或大小)分隔体积的方法，例如本文所述的线扫描法、简单边界法、反向分水岭法、圆检测法、组合的反向分水岭法和圆检测法、或其组合。在一些方面，检测或识别分隔体积的方法可以独立于确定样品浓度的方法。也就是说，除了进行本文所述的数字测定之外，检测或识别分隔体积的方法可以用于许多目的。用于本文描述的系统和方法的图像检测和图像分析方法的实例可以见于wo2015/157369和wo2012/100198，将其整体并入本文。在一些情况下，可以通过共聚焦显微术、线共聚焦显微术、反卷积显微术、旋转盘显微术、多光子显微术、平面照明显微术、贝塞尔光束显微术、微分干涉差显微术、相差显微术、表面荧光显微术、明场成像、暗场成像、倾斜照明或其组合进行光学成像。指令组当被处理器执行时可以使处理器确定在所述多个分隔体积中的至少一些中可检测试剂的存在或不存在。指令组当被处理器执行时还可以使处理器基于所述多个分隔体积中的可检测试剂的存在或不存在和确定的所述多个分隔体积的多个体积，确定所述多个分隔体积中的样品浓度。占据率的确定在一些方面，在已经确定分隔体积并确定其尺寸之后，可检测信号或代码(例如，发射强度、发射波长、发射寿命或光谱强度)可以用于确定靶分子是否存在或曾经存在于分隔体积中。分隔体积中靶分子的存在可导致分隔体积中探针的可检测信号或代码的一个或多个方面的检测的增加。在那些情况下，可以应用强度截止值(cutoff)或阈值标准，其中其强度超过截止值或阈值的分隔体积可被视为被靶分子占据。在一些情况下，其中可检测信号或代码的测量的方面都未达到截止值或阈值的分隔体积可以被认为是空的。从分隔体积测量的与截止值或阈值进行比较的值的非限制性列表可以包括：分隔体积内的平均强度；分隔体积内的峰值强度，信号或可检测代码的寿命，分隔体积内的光谱强度，或在分隔体积内测量的可检测信号或代码(或其缺少)的任何用户选择的函数(例如可以使用任何测量值的中位数或测量值的百分位数)。在一些情况下，可以将数字测定中的测量值归一化为已知值或相对值。例如，可以将扩增后做出的分隔体积中可检测信号或代码的测量值与扩增之前相同的分隔体积的测量值比较。在一些情况下，可将来自分隔体积的可检测信号或代码的测量值与已知值进行比较，所述已知值例如测量的来自包含空白或对照样品的分隔体积的可测量信号或代码。计算装置计算装置可以被编程以实施本文所述的一种或多种方法。该计算装置可以包括例如个人计算机、工作站或服务器。该计算装置包括处理器、计算机处理器、中央处理单元或cpu，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算装置还可包括存储器(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存、硬盘等)。存储器可以存储文件，例如由成像源拍摄的计算机可读图像文件。在一些情况下，计算装置可以包括在计算装置外部的一个或多个另外的数据存储单元，例如位于通过一个或多个网络与计算装置通信的远程服务器上。计算装置还可以包括输入/输出或i/o系统，该计算装置可以使用该输入/输出或i/o系统与以下进行通信：一个或多个用户us，一个或多个其他计算装置或系统，一个或多个网络(例如，局域网(lan)、外联网、内联网、互联网、电信网络、数据网络、蜂窝数据网络等)或一个或多个周边装置，包括成像源、外部存储器、各种适配器等。i/o系统可以包括显示器、用户界面和通信界面。例如，显示器可以包括触摸屏显示器，通过该触摸屏显示器，用户界面被投影到用户us。通信界面可以包括用于使计算装置连接到一个或多个网络的网络适配器。用户us例如可以通过一个或多个网络远程操作计算装置。例如，计算装置可以包括基于云的计算系统，例如分布式计算系统，其操作可以在用户us本地的成像源。计算装置可以通过一个或多个网络或通过直接通信与成像源通信。本文所述的方法可以通过存储在计算装置的电子存储位置上，例如，存储器或其他电子存储单元上的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)来实施。在使用期间，代码可以由处理器执行。在又一方面，该系统可以包括用于进行数字测量的计算机可读存储介质。所述计算机可读存储介质可以在其上存储指令，当计算机的一个或多个处理器执行所述指令时，所述指令使计算机：分析具有体积分布的多个分隔体积，以确定包含可检测试剂的多个所述分隔体积中的一些分隔体积；并使用多个分隔体积中的一些分隔体积的数量、多个分隔体积中的一些或全部分隔体积的体积以及包含一种或多种可检测试剂的第二多个分隔体积中的分隔体积的数量来确定样品中可检测试剂的浓度。计算机可读存储介质可以在其上存储指令，当计算机的一个或多个处理器执行所述指令时，所述指令使计算机操作本文所述的任何功能或方法。例如，指令可以在调节一个或多个分隔体积的温度时(例如，在扩增步骤期间)操作加热元件。指令还可以操作流体处理系统、基底处理系统(例如，对诸如多孔板或芯片的容器进行定位或重新定位)、操作成像源、检测系统或图像分析软件。本文中提供的系统和方法的多方面，例如计算装置，可以体现在编程中。技术的各个方面可以被视为“产品”或“制造品”，其通常为在机器可读介质上实施或以机器可读介质的类型体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以实现将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学陆线网络并通过各种空中链路跨本地装置之间的物理界面使用的光波、电波和电磁波。诸如有线或无线链路、光学链路等的携带这样的波的物理元件也可以被视为承载软件的介质。如本文所使用的，除非限于非临时有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。多路复用和自动化通过使用多路复用和自动化策略，可以在速度和效率方面进一步改进本文所述的方法、系统、试剂盒和装置。在多路复用方法中，可以快速连续地处理多个容器(例如，试管、微量滴定板、数字测定芯片等)(例如，负载试剂和目标分子，搅拌以形成分隔体积，循环通过数轮扩增，经受解链曲线加热方案，监测光谱强度的差异，逐滴测量和计数，逐滴分配值等，如本文所述的)。为了促进多路复用，可以通过能够单独使基底移动到每个步骤的位置的可移动样品托盘将基底堆叠并移动到位，以进行扩增和成像过程的单个步骤(例如，负载、搅动、加热、标记、检测、定量等)。基底针对每个步骤的这样的移动到位可以包括操作样品盘的齿轮，并且该齿轮可以由计算机处理器作为预先建立的程序的一部分来操作，该程序进而可以针对用于实验中的单个方案或可检测试剂进行定制。在一些实施方案中，给定数字测定方案中的多个步骤可以在相同位置发生，而不需要在步骤之间移动基底。激活和停用(多个)流动池(例如，以促进试剂和样品的混合和负载)、(多个)辐射源(例如，用于对光学可检测代码进行成像、进行测量、有意的光漂白和/或刺激可检测试剂)、(多个)温度控制装置、(多个)移动显微镜载台和(多个)过滤管以及(多个)检测器的方法可以自动化，以使本文所述的方法的所有、部分或一个步骤无需用户额外干预即可进行。由于这些方法可以根据本文所述的测定循环进行，因此通过采用本文所述的方法和系统，可以在短时间段内检测到多组探针或可检测试剂。因此，在一些实施方案中，所述系统可以包括开放或封闭的系统，其中用户可以启动程序(例如，预编程或用户定义的程序，其可以由处理器执行并且可以存储在非临时性计算机可读介质上，能够命令本文所述的任何方法步骤被执行)，并且程序的所有其他步骤均由系统自动执行。在一些实施方案中，仅在实验开始时(例如，插入底物和/或细胞和/或可检测的试剂，启动程序或计算机处理器)以及在结束时(例如，从计算机处理器获得结果，并且从系统移除试剂/废弃物)需要用户干预。在一些情况下，可以将用于进行如本文所述数字测定的多路复用或自动化系统设计成暂停以进行用户输入或用户干预。利用编码颗粒的多路复用数字分析测定可以用于询问每个分隔体积(例如，每个孔、分隔体积、腔或斑点)1至约1000、5至约500、约10至约200、约10至约150、约5至约125、约6至约100、约7至约90、约8至约80、约9至约75、约10至约60、约15至约50、约20至约45、约25至约40或约10至约30个靶分子。在一些情况下，容器可以包含1、10、100、500、1000、5000、10000、15000、20000、30000、50000、100000、200000、500000、1000000、2000000、5000000或10000000个分隔体积或由该列表中任意两个值限定的范围内的数值。在一些情况下，在多路复用数字分析测定过程中可以一次分析(例如，测定或成像)1、10、100、500、1,000、5000、10000、15000、20000、30000、50000、100000、200000、500000、1000000个分隔体积(或由该列表中任意两个值限定的范围内的数值)。多路复用期间可检测信号和代码的检测通过整体评价每个分隔体积的可检测信号或代码的存在，而不是单个评价每个探针或位于其中的编码颗粒的可检测信号或代码，可以改善多路复用数字测定的效率。如本文所述，在数字测定的检测步骤的过程中，可以使用能够基于每个颗粒(或每个颗粒集群或颗粒聚集体)解析(例如检测)分隔体积中的多个可检测代码或信号的成像镜头(例如，显微镜物镜)。如本文所述，当在数字测定中使用高通量多路复用工作流程时，采用设计或优化用于整体评价每个分隔体积的检测方案可以是有利的。也就是说，可以使用被设计成对分隔体积整体成像和评价(例如，检测和分析)的方法和系统，而不是采用单个地解析分隔体积中的多个可检测代码或信号所需的方法和系统(例如，使用能够解析和/或量化单个探针的可检测信号的高功率物镜和/或软件，这在资金上、在计算上或在时间上可能是昂贵的)。因此，可以整体评价单个分隔体积并基于分隔体积中的可检测代码或信号是否满足或超过阈值(例如，相对于在扩增步骤之前通过检测分隔体积而建立的基线值)来分配二进制值。在一些情况下，可以同时检测和/或分析多个分隔体积。因此，通过整体评价每个分隔体积，通过检测多个分隔体积中的可检测代码或信号，可以改善多路复用数字测定的总体效率。在一些情况下，当多个可检测信号或代码(或其部分)位置彼此紧密接近(例如，空间上集中)时，可以更容易地检测多个可检测信号或可检测代码(例如由包含靶分子的分隔体积中的多个探针产生的，如本文所述)。多个可检测信号或代码的空间集中可通过使产生多个可检测信号或代码的多个探针关联、聚集或在空间上集中来实现(例如，通过使所述多个探针交叉杂交、交联、晶格化或形成网络，如本文所述)。在一些情况下，分隔体积中的多个可检测信号或代码的空间集中可以增加在分隔体积内产生的总体可检测信号或代码的视在强度。通过增加在分隔体积内产生的总体可检测信号或代码的视在强度，可以使用较低功率的物镜和/或需要花费更少的时间来检测分隔体积(例如，数字化体积)中靶分子的存在。因此，如果探针可以在靶分子的存在下在空间上在每个分隔体积中集中，则有可能更有效地确定多个分隔体积中靶分子的存在或不存在(例如，如本文所述和如图6f、图6h、图6j、图6k和图6l中示出的)。进行数字测定的组合物和试剂盒本发明提供了用于进行如本文所述的数字测定的组合物和试剂盒。在某些方面，提供试剂盒和测定用于进行数字分析，如数字核酸分析、数字pcr、解链曲线或等温测定。在各个方面，本发明提供了用于进行数字测定的组合物和试剂盒，其包含：第一流体；第二流体，其中第一流体和第二流体彼此不混溶并且在搅动时能够形成乳液；表面活性剂；和扩增试剂。在一些方面，本发明提供了用于进行数字测定的组合物和试剂盒。数字测定组合物或试剂盒可以包含第一流体和第二流体，其中第一流体和第二流体彼此不混溶，并且在物理搅动时能够形成乳液。试剂盒或组合物还可以包含表面活性剂和数字测定试剂。在另外的方面，数字测定试剂可以包括聚合酶(例如，热稳定的dna聚合酶)，或适合延伸核酸、核苷酸、环化核酸、猝灭剂、引物、探针、编码颗粒、结合区、荧光标记或可检测试剂(例如，嵌入染料)的其他酶或其组合。在另外的方面，组合物和试剂盒还可以包含与pcr扩增相容的合适的缓冲剂和稳定剂。在本文提供数值范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则达到下限单位的十分之一、在该范围的上限和下限之间的每个居中值，以及在该范围内的其他指定制或居中值都涵盖在本文提供的发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在所述较小的范围中，并且也应包括在本发明之内，遵守所述范围内任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些所包括的极限中的任一个或两个的范围也包括在本文提供的发明中。本发明的设备、装置、系统及其组件中任一个的具体尺寸可以根据预期的应用容易地变化，如考虑到本文的公开内容后将对本领域技术人员显而易见的。此外，应当理解，本文描述的实施例和方面仅出于说明目的，并且可以向本领域技术人员提示基于其的各种修改或改变，并且所述各种修改或改变包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文描述的方面的许多不同组合是可能的，并且这样的组合被认为是本技术实现要素：的一部分。另外，就本文的任何一个方面讨论的所有特征可以容易地适于用于本文的其他方面。在不同方面中针对相似特征使用不同术语或附图标记并不一定意味着与明确阐述的那些不同的差异。因此，旨在仅参考所附权利要求来描述本发明，并且本发明不限于本文公开的方面。除非另有说明，否则可以以任何顺序进行本发明描述的方法和过程。例如，对于描述步骤(a)、(b)和(c)的方法，可以首先进行步骤(a)，然后进行步骤(b)，然后进行步骤(c)。或者，该方法可以以不同的顺序进行，例如，首先是步骤(b)，接着是步骤(c)，然后是步骤(a)。此外，除非另有特别说明，否则这些步骤可以同时或分别进行。虽然本文已经示出和描述了本发明的优选方面，但是应当理解，由于可以做出特定方面的变型并且仍然落入所附权利要求的范围内，所以本发明不限于以下描述的公开内容的特定方面。还应理解，所采用的术语是出于描述本发明的特定方面的目的，并且不旨在进行限制。相反，本发明的范围由所附权利要求书确定。在本说明书和所附的权利要求书中，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文。实施例鉴于本文的公开内容，将对本领域技术人员显而易见的是，本发明的设备、装置、系统及其组件中任一个的具体尺寸可以根据预期的应用容易地变化。此外，应当理解，本文描述的实施例和方面仅用于说明目的，并且可以向本领域技术人员提示根据其的各种修改或改变，并且所述修改或改变包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文描述的方面的许多不同组合是可能的，并且这样的组合被认为是本发明的一部分。另外，就本文的任何一个方面讨论的所有特征可以容易地适于在本文的其他方面中使用。在不同方面中针对相似特征使用不同术语或附图标记并不一定意味着不同于明确阐述的特征的差异。因此，旨在仅参考所附权利要求来描述本发明，并且本发明不限于本文公开的方面。实施例1在数字pcr中用编码颗粒检测靶分子的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，在使用数字pcr检测靶分子的靶序列中使用编码聚合物点纳米颗粒的示例性方法。图4描绘了包含与编码聚合物点纳米颗粒连接的结合区的探针。在自数字化(sd)芯片的每个数字化体积(例如腔室)中，在1纳升反应混合物中提供编码聚合物点探针，每个探针均包含三个不同类型的荧光发色团。在扩增之前，使得各自包含核酸结合区的编码聚合物点探针与三种类型的所提供的猝灭剂的核酸分子区域杂交。每个独特猝灭剂(例如，猝灭剂的类型或每个猝灭剂的种类)连接到能够与编码聚合物点探针的核酸结合区的特定序列杂交的相同核酸序列，组合的猝灭剂能够猝灭作为编码聚合物点的部分的三个荧光发色团组的荧光。反应混合物包含taqmanfastadvancedmastermix，包含靶核酸分子(例如模板)的样品，taqman聚合酶，反应缓冲液，包含编码聚合物分子的溶液以及包含设计成识别靶分子的其余定制pcr引物的溶液。在扩增之前，用激光在荧光发色团的峰值激发频率范围内刺激已实现与猝灭剂杂交的编码聚合物点探针，并且在背景水平下确认了其来自腔室的光谱强度发射。使用热循环仪，在芯片的每个数字化体积中进行数字pcr反应，在95℃下进行3分钟的热启动，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。猝灭剂结合的引物在基于pcr的扩增过程中被掺入扩增产物中，并与互补扩增产物杂交，而不是与编码聚合物点纳米颗粒的结合区杂交。腔室再次受到激发激光的刺激，并检测到由于编码聚合物点探针的发射而产生的光学可检测代码。基于从每个腔室检测到的光谱强度测量值，为腔室分配数字值，并使用泊松统计以及(通过编码聚合物点的光学可检测代码的可检测的发射)指示靶分子的存在的腔室数量，(通过未检测到编码聚合物点的光学可检测代码)指示靶分子的不存在的腔室数量和每个反应体积的体积，来反算样品中靶分子的浓度。实施例2使用猝灭剂-缀合的聚合物点探针的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和猝灭剂-缀合的聚合物点检测靶分子的方法。通过将水相和油相添加到包含小不锈钢珠的小收集微管产生分隔体积，其中水相包含反应混合物，所述反应混合物包含taqmanfastadvancedmastermix、包含靶核酸分子(例如，模板)的样品、taqman聚合酶、反应缓冲液，设计成识别靶分子的定制pcr引物对以及编码发色团聚合物点探针，所述编码发色团聚合物点探针通过能够与靶分子的互补链的部分杂交的核酸序列栓系到约200个猝灭剂。猝灭剂共价连接到核酸序列的远端，其近端共价连接到聚合物点。随后将管在15-17hz下摇动20秒以产生包含多个分隔体积的乳液。分隔体积的数量和单个尺寸通过光学方法确定。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在扩增子(例如，由模板产生的扩增产物)的扩增过程中，已退火成扩增子的部分的探针的猝灭剂栓系的核酸序列被taqman聚合酶消耗。taqman聚合酶消耗了使猝灭剂栓系到探针的核酸后，猝灭剂就从探针释放出来(如图6a中所示)。热循环后，用450nm激光激发分隔体积。游离猝灭剂和聚合物点之间的距离增加使得编码聚合物点的光学可检测代码被检测到。从每个分隔体积以光学方式检测发射光谱，并基于聚合物点探针的发射光谱特征是否在孔中被检测到，将数字值分配给每个分隔体积。在缺少靶分子的分隔体积中，在热循环过程中不产生扩增子，并且猝灭剂的核酸序列不被消耗，使猝灭剂仍与聚合物点杂交，保持紧密接近并继续猝灭聚合物点的光学可检测代码。这些对扩增和光学可检测代码为负性的分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布与分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例3使用具有自退火结合区的猝灭剂-缀合的聚合物点探针的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和具有自退火结合区的猝灭剂-缀合的聚合物点来确定靶分子浓度的方法。通过使水相流动通过微流体装置产生分隔体积，该微流体装置由通道和隔室的网络组成，该通道和隔室的网络构成预先充满油相的自数字化装置，然后使另外的油相流动通过该装置。每个分隔体积中的编码聚合物点通过dna序列与猝灭剂缀合。每个序列具有三个结合区。dna的近端和远端的短区域(例如6个碱基对)是互补的，因此彼此结合形成发夹结构(如图6b中所示)。中间区域能够与扩增子(例如，靶分子的扩增产物)杂交。在分隔体积中还提供了靶核酸分子(例如模板)、taqman聚合酶、反应缓冲液以及第一和第二寡核苷酸引物，其中能够与模板杂交并充当模板扩增的起始点的第二寡核苷酸引物以比第一寡核苷酸引物更高的浓度提供，所述第一寡核苷酸引物能够与扩增子杂交并充当扩增子扩增的起始点(例如，以产生另外的靶分子的拷贝)。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，然后进行30个以下循环：分别在95℃下30秒，54℃下30秒和72℃下30秒。因为第二寡核苷酸引物的相对浓度较高，所以与靶分子的扩增子拷贝相比，产生了更多的扩增子拷贝。这产生了单链dna，所述单链dna然后可以与聚合物点探针的中间结合区杂交，使结合区从聚合物点延伸出来，并使猝灭剂和聚合物点之间的距离增加到聚合物点的光学可检测代码不再被猝灭剂猝灭并且可以被检测到的程度。如上所述，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。缺少靶分子的分隔体积不产生扩增子，并且自退火核酸结合区没有延伸，使得猝灭剂继续猝灭聚合物点的光学可检测代码(图6b中未显示)。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例4使用扩增介导的猝灭剂竞争的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用涉及扩增介导的猝灭剂竞争的数字pcr的方法来检测和定量靶分子的方法。在微流体装置中的t形连接处产生分隔体积，其中水相从侧通道流入油流动的主通道，结合流在油相内产生基于水相隔室的小滴或塞。每个分隔体积中的编码聚合物点缀合到核酸结合区。这些结合区既与连接到猝灭剂的核酸结合区互补，又与它们可以充当引物的靶分子互补。当猝灭剂与聚合物点的核酸结合区杂交时，猝灭剂能够吸收由聚合物点产生的光学可检测代码。连接到聚合物点的核酸结合区包含引物，所述引物能够与靶分子的末端附近的区域杂交，并在pcr试剂的存在下在热循环过程中充当靶分子扩增的起始点。pcr试剂(例如pcr反应缓冲液、taq聚合酶和靶分子)存在于分隔体积中。在分隔体积中还提供了引物的拷贝，所述引物的拷贝能够与靶分子的扩增子(例如，靶分子的pcr扩增产物)杂交，并在pcr试剂的存在下在热循环过程中充当扩增子扩增的起始点。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下40秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在循环期间，通过pcr反应产生靶分子(例如模板)和扩增子二者的拷贝。当产生更多靶分子的拷贝时，就与聚合物点的核酸结合区的杂交而言，与猝灭剂相比，靶分子的拷贝获得了化学计量上的优势。在循环期间，靶分子与聚合物点的核酸结合区杂交，置换猝灭剂，增加聚合物点和猝灭剂之间的距离，并使得聚合物点的光学可检测代码被检测到。如上所述，检测到光学可检测的代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。缺少靶分子的分隔体积不产生扩增子和另外的靶分子的拷贝，并且猝灭剂不从与聚合物点的核酸结合区的杂交置换，使得猝灭剂继续猝灭聚合物点的光学可检测代码(图6c中未示出)。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例5使用竞争性杂交的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用利用诱捕物介导的竞争性杂交的数字pcr检测和定量靶分子的方法。在微流体装置中的连接处产生分隔体积，其中水相在加号(或交叉)连接处以“流动聚焦”方式遇到两个会聚的油相，产生小滴隔室。在每个分隔体积中的编码聚合物点缀合到核酸结合区，所述核酸结合区能够与包含猝灭剂的核酸引物序列杂交。猝灭剂包括能够吸收由聚合物点和核酸引物序列产生的光学可检测代码的猝灭剂，并且在分隔体积中过量提供。本身作为引物，猝灭剂的核酸引物序列能够在pcr扩增步骤中延伸。核酸结合区包含引物，所述引物能够与靶分子的末端附近的区域杂交，并在pcr试剂的存在下在热循环过程中充当靶分子扩增的起始点。pcr试剂(例如pcr反应缓冲液、taq聚合酶和靶分子)存在于分隔体积中。在分隔体积中还提供了引物的拷贝，所述引物的拷贝能够与靶分子的扩增子(例如，靶分子的pcr扩增产物)杂交，并在pcr试剂的存在下在热循环过程中充当扩增子扩增的起始点。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在循环期间，通过pcr反应产生靶分子(例如模板)和扩增子二者的拷贝。此外，猝灭剂引物在扩增过程中延伸，使其与靶分子的全长杂交。随着更多靶分子的拷贝的产生以及猝灭剂引物序列在扩增过程中的延伸，猝灭剂引物序列开始与靶标的拷贝而不是与聚合物点的核酸结合区关联。由于延伸的猝灭剂引物序列和靶分子的拷贝的关联，聚合物点和猝灭剂之间的距离增加，实现检测光学可检测代码。如上所述，检测到光学可检测的代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。缺少靶分子的分隔体积不产生扩增子和另外的靶分子的拷贝，并且猝灭剂引物不延伸或从与聚合物点的核酸结合区的杂交中被置换，使得猝灭剂继续猝灭聚合物点的光学可检测代码(图6d中未显示)。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与测量的分隔体积尺寸匹配。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例6使用探针内和/或探针间扩增和杂交的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和缀合到匹配的引物组的聚合物点检测和定量靶分子的方法。在装置中产生分隔体积，其中水相和油相在同轴连接处相遇，其中来自内部通道的水相被来自外部通道的油的鞘流包围，并形成小滴隔室。在每个分隔体积中的编码聚合物点与第一组核酸结合区缀合，所述第一组核酸结合区是引物，并且能够在扩增子的5’端与靶分子的扩增子的部分(例如，靶分子的pcr扩增产物)杂交。聚合物点还与第二组核酸结合区缀合，所述第二组核酸结合区是引物，并且能够在靶分子的5’端与靶分子的部分杂交。除了靶分子、pcr反应缓冲液、核苷酸和taq聚合酶之外，在分隔体积中提供了能够与第一组核酸结合区的核酸结合区杂交的猝灭剂缀合的寡核苷酸。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在循环期间，靶分子及其pcr扩增产生的扩增子的拷贝与第二和第一组核酸结合区杂交，延长了每组核酸结合区的成员的长度(如图6e中所见)。靶分子和扩增子二者均在每轮中扩增，导致与猝灭剂缀合的寡核苷酸相比，与聚合物点的核酸结合区的结合的化学计量优势。第一组或第二组的pcr延伸的核酸结合区可以在随后的pcr扩增轮次中分别与第二组或第一组的未延伸的引物区杂交。第一组的pcr延伸的核酸结合区可以与第二组的pcr延伸的核酸结合区杂交，如图6e中所示。任一组的pcr延伸的核酸结合区也可以与相邻聚合物点探针的核酸结合区以及靶分子或其扩增子的拷贝杂交，如图6f中所示。图6e和图6f中示出的机制都可以在相同的分隔体积中发生，并且每种机制都足以竞争性地抑制猝灭剂缀合的寡核苷酸与聚合物点探针的核酸结合区的杂交。猝灭剂缀合的寡核苷酸的解离使得由聚合物点产生的光学可检测代码被检测。在对以上描述的微小变型中，两个结合区的比例不必为1:1的比例。实际上，可能存在两个相同聚合物点的群。如图6k中所示，一个具有例如6:4的第一和第二结合区域的比例，另一个具有4:6的第一和第二结合区域的比例。更多细节参见实施例11。如上所述，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。在缺少靶分子的分隔体积中，两组核酸结合区均不具有在其上延伸的模板，并且猝灭剂缀合的寡核苷酸保持与聚合物点紧密关联。因此，分隔体积中的光学可检测代码保持猝灭，并且未检测到光学可检测代码。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。在进行数字pcr以确定靶分子浓度的该方法的微小变型中，在分隔体积中提供了具有与第一和第二核酸结合区相同序列的游离寡核苷酸引物，如图6g和图6h中所示。能够扩增靶分子和扩增子的游离引物的添加为pcr扩增的早期循环的核酸结合区延伸提供了更多模板，加速了猝灭剂缀合的寡核苷酸的竞争性抑制。如上所述以及如图6g和图6h中所示，pcr延伸的核酸结合区将结合于相同的聚合物点上(如图6g中所示)、分隔体积中的其他聚合物点上(如图6h中所示)或靶分子或其扩增子的拷贝上(如图6h中所示)的互补结合区。这些变型机制的检测和分析以与本实施例之前所述相同的方式进行。实施例7使用聚合酶诱导的分子裂解的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和猝灭剂-缀合的聚合物点检测和定量靶分子的方法。在微流体装置中产生分隔体积，其中水相通过许多平行的孔或通道出现在油相中，同时产生许多小滴。每个分隔体积中的编码聚合物点缀合到核酸结合区。核酸结合区能够与扩增子的部分(例如靶分子的扩增产物)杂交，如图6i中所示。在分隔体积中还提供了靶核酸分子(例如，模板)、聚合酶和反应缓冲液。在每个分隔体积中还提供了猝灭剂缀合的寡核苷酸，其能够与聚合物点的核酸结合区和靶分子的部分杂交。在每个分隔体积中还提供了第一和第二寡核苷酸引物，其中第二寡核苷酸引物能够与靶分子的5’端杂交并充当靶分子扩增的起始点。第一寡核苷酸引物能够与扩增子的5’端杂交，并充当扩增子扩增的起始点(例如，以产生靶分子的额外拷贝)。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是30个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。如图6i中所示，如果采用聚合酶进行扩增的扩增子与核酸结合区同时关联，则聚合物点的核酸结合区在pcr循环的延伸阶段期间被破坏。类似地，如果猝灭剂缀合的寡核苷酸与同时通过taqman聚合酶和第二寡核苷酸引物进行扩增的靶分子杂交，则猝灭剂缀合的寡核苷酸的寡核苷酸区域在pcr循环的延伸阶段期间被破坏。由于在介导的pcr扩增过程中聚合物点的核酸结合区被破坏，并且猝灭剂结合的寡核苷酸的寡核苷酸区域被破坏，因此猝灭剂不具有与聚合物点关联的能力，并且可以检测光学可检测代码。如上所述，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。缺少靶分子的分隔体积不产生扩增子，并且猝灭剂缀合的寡核苷酸的寡核苷酸区域和聚合物点的核酸结合区都没有被破坏。因此，猝灭剂能够猝灭缺少靶分子的分隔体积中聚合物点的光学可检测代码。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例8使用探针间杂交的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和互补聚合物点探针检测和定量靶分子的方法。在装置中产生分隔体积，其中水相通过多孔膜出现在油相中，同时产生许多小滴。每个分隔体积中的第一组编码的发色团聚合物点与第一组核酸结合区缀合，所述第一组核酸结合区是引物，并且能够在扩增子的5’端与靶分子的扩增子的部分(例如，靶分子的pcr扩增产物)杂交。将第二组编码的发色团聚合物点缀合到第二组核酸结合区，所述第二组核酸结合区是引物，并且能够在靶分子的5’端与靶分子的部分杂交。除了靶分子、pcr反应缓冲液、核苷酸、引物和taq聚合酶以外，还在分隔体积中提供能够与第一组核酸结合区的核酸结合区杂交的第一组猝灭剂缀合的寡核苷酸和能够与第二组核酸结合区的核酸结合区杂交的第二组猝灭剂缀合的寡核苷酸。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在循环期间，靶分子及其pcr扩增产生的扩增子的拷贝与第二和第一组核酸结合区杂交，延长了每组核酸结合区的成员的长度(如图6j中所见)。靶分子和扩增子二者的数目也在每轮中扩增。在第一类型的聚合物点上的第一组的pcr延伸的核酸结合区可以与在第二类型的聚合物点上的第二组的pcr延伸的核酸结合区杂交，形成聚集的结构并从聚合物点的核酸结合区解离猝灭剂缀合的寡核苷酸。如上所述，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。在缺少靶分子的分隔体积中，在第一和第二类型的聚合物点上的第一和第二类型的核酸结合区的自发杂交仅以低水平发生。在所有分隔体积中都将存在检测的背景水平，并且用于分配给分隔体积的值为“1”的阈值通过系统处理器评价并自动调整。系统软件中还提供了用于手动调整信号阈值的选项。因此，光学可检测代码的低水平检测未使系统无法操作。相反，不产生具有足够光谱强度的可检测代码的分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。与实施例6中那样，通过提供与连接到聚合物点的第一和第二组核酸结合区具有相同的序列的第一和第二组寡核苷酸引物，可以提高(例如“增强”)反应效率。实施例9使用不平衡探针间杂交的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和具有不平衡结合区组的猝灭剂-缀合聚合物点检测和定量靶分子的方法。在装置中产生分隔体积，其中水相通过微流体过滤器或分流通道出现在油相中，同时产生许多小滴。在每个分隔体积中的编码聚合物点与第一组核酸结合区缀合，所述第一组核酸结合区是引物，并且能够在扩增子的5’端与靶分子的扩增子的部分(例如，靶分子的pcr扩增产物)杂交。还将聚合物点缀合到第二组核酸结合区，所述第二组核酸结合区是引物，并且能够在靶分子的5’端与靶分子的部分杂交。每个聚合物点上的第一组结合区与第二组结合区的比率在每个分隔体积中提供的第一组聚合物点上为60:40，在每个分隔体积中提供的第二组聚合物点上为40:60。供选择地，也可以使用70:30而不是60:40的比率。除了靶分子、pcr反应缓冲液、核苷酸和taq聚合酶以外，还在分隔体积中提供能够与第一组核酸结合区的核酸结合区杂交的猝灭剂缀合的寡核苷酸。使分隔体积经受95℃热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在循环期间，靶分子及其pcr扩增产生的扩增子的拷贝与第二和第一组核酸结合区杂交，延长了每组核酸结合区的成员的长度(如实施例8中所示)。靶分子和扩增子二者的数目也在每轮中扩增，导致与猝灭剂缀合的寡核苷酸相比，与聚合物点的核酸结合区的结合的化学计量优势。第一组或第二组的pcr延伸的核酸结合区可以在随后的pcr扩增轮次过程中分别与第二组或第一组的未延伸的引物区杂交。第一组的pcr延伸的核酸结合区可以与第二组的pcr延伸的核酸结合区杂交。然而，如图6k中所示，由于每个聚合物点上的结合区的比例不平衡，任一组聚合物点的pcr延伸的核酸结合区将比与相同聚合物点的结合区更频繁地与相邻聚合物点探针的结合区杂交。颗粒间杂交导致猝灭剂缀合的寡核苷酸与聚合物点解离。猝灭剂缀合的寡核苷酸的解离使得聚合物点产生的光学可检测代码被检测到。由于聚合物点小于像素分辨率和/或衍射极限分辨率，因此对于集群的聚合物点，在集群中单个像素的亮度应比分离的聚合物点的亮度明显更亮。除单个聚合物点的总体点尺寸外这是更亮的。如在实施例6中那样，通过提供第一和第二组寡核苷酸引物可以提高(例如，“增强”)反应效率，所述第一和第二组寡核苷酸引物具有与连接到聚合物点的第一和第二组核酸结合区相同的序列。如上文进一步描述的，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。在缺少靶分子的分隔体积中，两组核酸结合区均不具有在其上延伸的模板，并且猝灭剂缀合的寡核苷酸保持与聚合物点紧密关联。因此，分隔体积中的光学可检测代码保持猝灭，并且未检测到光学可检测代码。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例10使用滚环扩增的数字pcr的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字pcr和猝灭剂-缀合的聚合物点检测靶分子的方法。在装置中产生分隔体积，在该装置中水相通过平行阶跃连接出现在油相中，从而同时产生许多小滴。在每个分隔体积中提供：与寡核苷酸缀合的聚合物点，过量的具有猝灭剂和能够与聚合物点的寡核苷酸杂交的寡核苷酸的猝灭剂引物，设计成包含其互补序列能够与猝灭剂引物的寡核苷酸杂交的序列的环化单链dna序列，能够与环化dna序列杂交并充当扩增的引物和引发剂的靶分子(例如触发分子)，反应缓冲液(trishcl，ph8.5，mgcl2，kcl，dtt，二甲基亚砜)，dntp和bst聚合酶。分隔体积经受在60℃下的等温条件。在rca等温扩增过程中，触发分子与环化dna杂交，然后使环化dna扩增。随着环化dna的扩增，产生了与猝灭剂引物寡核苷酸序列互补的杂交位点。滚环扩增产生的杂交位点数量产生相对于聚合物点的寡核苷酸的化学计量优势，并且猝灭剂引物与滚环扩增产物关联，而不是与聚合物点寡核苷酸关联，使猝灭剂与聚合物点分开，并使得聚合物点的光学可检测代码被检测到。如上所述，检测到光学可检测代码，并且包含靶分子的分隔体积被分配的值为“1”。缺少靶分子的分隔体积未启动滚环扩增，并且使得猝灭剂继续猝灭聚合物点的光学可检测代码。其中无法检测到来自聚合物点的信号的这些分隔体积被分配的值为“0”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例11空间解链曲线分析的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，使用数字空间解链曲线分析确定靶分子的序列的方法。将含有核酸靶分子的样品转移到工作缓冲液中，所述工作缓冲液包含trishcl，ph8.5，mgcl2，kcl，dtt和二甲基亚砜。然后将样品工作缓冲液混合物稀释到包含kcl、mgcl2、dtt和三磷酸核苷的试剂再水化缓冲液中。将逆转录酶、t7rna聚合酶、rna酶h、扩增引物、包含编码聚合物点(pdot)纳米颗粒和结合区的探针以及具有与探针的结合区和靶分子二者互补的序列并能够与探针的结合区和靶分子二者杂交的猝灭剂引物核酸加到包含靶分子的混合物，然后将溶液送入二维规则反应腔室阵列的入口。腔室的二维阵列被组织成使得该阵列的垂直轴包含相同的重复，并且水平轴的连续腔室代表实验条件，其中在解链曲线分析期间施加热能的过程中，温度将从一端到另一端递增升高(例如，图11a和图11b中的“a”到“a’”)。在扩增之前，用波长为470nm的激发激光刺激反应腔室，并收集和分析从每个反应腔室发射的光。将加热元件放置成与包含靶分子和等温扩增试剂的腔室接触或紧密接近，将其校准以将反应腔室的分隔体积加热至41℃，并在等温扩增期间维持该温度，如图11a和图11b中所示。扩增后，跨装置建立从50℃到90℃的温度梯度，每区室列的温度阶跃为0.25℃。探针将根据其特定解链温度(tm)与扩增产物杂交或去杂交，产生序列特异性解链曲线指纹图谱。用波长为470nm的激发光刺激反应腔室，并在500nm至700nm的范围内检测从反应腔室发射的光。相对荧光值记录为空间解链曲线，使归一化的在阵列的每个水平位置处发射的荧光与阵列的该位置处的温度相关。然后通过使空间解链曲线上的荧光变化与存在单次或多次出现的腺嘌呤-胸腺嘧啶(a-t)碱基对或鸟嘌呤-胞嘧啶(g-c)碱基对相关联，基于荧光变化的幅度，检测发生荧光变化的水平位置的绝对温度，或者自最后一次荧光变化被检测到以后阵列中的水平空间间隔，确定样品中靶分子的序列。实施例12在分隔体积中个别检测多个可检测信号的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，通过个别检测多个可检测代码来定量靶分子的示例性方法。在多个分隔体积中的每个中的1纳升(nl)反应混合物中提供编码探针，所述多个分隔体积位于自数字化芯片的多个腔室中，所述编码探针包含荧光聚合物点、多个核酸结合区和能够与探针的结合区杂交的多个猝灭剂。反应混合物包含taqmanfastadvancedmastermix、taqman聚合酶、反应缓冲液、编码探针和部分样品，其中所述样品包含未知浓度的靶核酸分子(例如模板)。在pcr扩增之前，使猝灭剂的核酸区域与核酸结合区杂交。在扩增之前，在荧光聚合物点的峰值激发频率范围内用激光刺激每个分隔体积的内容物，并测量背景荧光或每个探针发射的可检测代码的光谱强度。在扩增之前，猝灭剂的存在有效地使探针无荧光(图12d)。使用热循环仪在芯片的每个分隔体积中进行数字pcr反应，在95℃下热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在扩增过程中，猝灭剂通过如实施例1-12中任一个所述的机理与探针的结合区解离。在扩增之后，在荧光聚合物点的峰值激发频率范围内再次用激光刺激每个分隔体积的内容物，并测量每个探针发射的可检测代码的光谱强度。靶核酸的存在导致来自可检测代码的荧光在pcr扩增后显著增加(图12e)。记录每个探针测量的光谱强度，并将其与预定阈值或数值范围比较。包含具有其值小于阈值的可检测代码的分隔体积的芯片腔室对于该代码被分配给的值为“0”，而具有其值大于或等于阈值或在值的预定范围内的可检测代码的分隔体积的腔室被分配的值为“1”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和针对不同的可检测代码的分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算对应可检测代码的靶分子的浓度。实施例13确定分隔体积中可检测信号的存在的方法该实施例提供了根据本发明的一个方面，通过在每个分隔体积基础上检测自数字化芯片的多个腔室中的可检测代码来量化靶分子的示例性方法。在芯片的多个腔室(例如，隔室体积)的每个中的1纳升(nl)的反应混合物中提供编码颗粒。每个编码颗粒包含荧光聚合物点、多个核酸结合区和能够与探针的结合区杂交的多个猝灭剂，并且反应混合物包含taqmanfastadvancedmastermix、taqman聚合酶、反应缓冲液、编码探针和部分样品，其中所述样品包含未知浓度的靶核酸分子(例如模板)。在pcr扩增之前，使猝灭剂的核酸区域与核酸结合区杂交。在扩增之前，在荧光聚合物点的峰值激发频率范围内用激光刺激每个分隔体积的内容物。检测自数字化芯片的每个分隔体积的光谱强度值。将每个分隔体积中每个聚合物点产生的总体光谱强度测量为单个值，以建立分隔体积中每个聚合物点的背景光谱强度值。使用热循环仪在芯片的每个分隔体积中进行数字pcr反应，在95℃下热启动3分钟，接着是35个以下循环：分别在95℃下30秒，在54℃下30秒以及在72℃下30秒。在扩增过程中，猝灭剂通过如实施例1-12中任一个所述的机理与探针的结合区解离。在扩增之后，在荧光聚合物点的峰值激发频率范围内再次用激光刺激每个分隔体积的内容物，并测量分隔体积中的每个编码聚合物点产生的光谱强度。检测并记录芯片的每个分隔体积中每个聚合物点的光谱强度值。将扩增后测量的光谱强度值与预定阈值或值范围比较。具有包含光谱强度值小于阈值的分隔体积的芯片腔室的p点被分配的值为“0”，并且光谱强度值大于或等于阈值或在值的预定范围内的分隔体积内的p点被分配的值为“1”。将数字值与相应的测量的分隔体积尺寸匹配，以在分隔体积尺寸分布和针对不同的编码p点分配的值之间产生关联。然后通过将测量的和计算的数据拟合到泊松分布曲线来反算靶分子的浓度。实施例14基于混合互穿sio2-p点的探针生成方法该实施例提供了使用混合互穿sio2-p点生成探针的示例性方法。具有不同吸收和发射光谱的三种不同类型的p点、p点450、p点540、p点610(图12a、12b)各自与三个不同的核酸序列缀合，所述序列设计用于检测hpv16、18和45。然后，使用动态光散射表征与核酸缀合的三个各自的p点，即p点450-hpv45(或p点450-45)、p点540-hpv16(或p点540-16)、p点610-hpv18(或p点610-18)，显示约30-40nm的流体动力学直径、ζ电位测量值和量子产率(qy)(参见下表1)。表1.根据本发明的实施方案的三种类型的sio2/聚合物-p点-dna的动态光散射(dls)、ζ电位(zp)和量子产率(qy)表征。dls-25czpqyp点450-hpv4533.9±3.2-41.30.59p点540-hpv1637.2±4.3-43.70.37p点610-hpv1839.9±5.7-42.20.68表征各个p点-核酸以定量缀合到每个p点的核酸分子的数量。图12c显示了电泳结果，用于定量p点450-45、p点540-16和p点610-18上的每个p点的杂交dna的数量。将不同浓度(0.1至1μm)的tamra-dna以及互补tamra-dna(1um)和p点-dna(p点450-45、p点540-16或p点610-18，2.8nm)的混合物负载到1wt％的琼脂糖凝胶中。从不同浓度的染料tamar的荧光强度(激发的532nmled)，获得了tamra-dna浓度对荧光强度的函数。从该函数可以计算出，在一个p点450-45上杂交的dna分子平均约为106个，在一个p点540-16上杂交的dna分子平均约为81个，在一个p点610-18上杂交的分子平均约为69个。为了进一步制备用于数字pcr的三种不同类型的p点-dna探针，使它们与其各自的互补bhq-dna猝灭剂杂交。图12d显示2ppm的p点450-45(a)、p点540-16(b)和p点610-18(c)，以及与各自的p点-dna杂交的具有各种浓度的互补bhq-dna(100nm，200nm)的p点的荧光。在靶核酸(hpv16、18、45)存在下的pcr或数字pcr后，各个p点-dna中的每个变得发荧光(图12e)，因为在扩增过程中，猝灭剂通过以上实施例中描述的机制与各个探针的结合区解离。采用凝胶电泳进一步证实了来自靶核酸的扩增产物的存在(图12f)。实施例15数字pcr和单探针成像和解码的方法该实施例提供了使用混合互穿的sio2–p点进行数字pcr的示例性方法，以及单个混合互穿sio2–p点的单颗粒成像和解码。根据之前的实施例，制备了三种不同类型的p点(p点450、p点540、p点610)，其各自与设计用于检测hpv16、18和45的三种不同的核酸序列缀合。三个各自的p点是：p点450-hpv45(或p点450-45)、p点540-hpv16(或p点540-16)、p点610-hpv18(或p点610-18)。随后将这些p点用于进行数字pcr，为此在自数字化(sd)芯片上生成分隔体积，此后如之前的实施例中所述对分隔体积进行热循环。热循环后，sd芯片用473nm激发光照射并成像，其中较暗的体积指示靶标扩增(图12g)。另外，将各自的三种不同类型的p点(p点450-45、p点540-16、p点610-18)中的每个单独的p点以单颗粒水平成像并解码(图12h)。实施例16使用探针间杂交的多路复用数字pcr的方法该实施例提供了使用p点-dna探针的探针间杂交进行数字pcr的示例性方法。各自与不同的dna序列缀合(p点450缀合到dna5’-acatgtattacac-3’；p点540缀合到dna5’-tactaaccggtttcg-3’；p点610缀合到dna5’-acatgtattacac-3’)的三种不同类型的p点(p点450、p点540、p点610)被用作示范。在与结合到p点的每个dna序列中存在的核酸序列互补的交联的dna序列(即，5’-acatgtattacactactaaccggtttcgacatgtattacac-3’)的存在下，p点被迫共定位并形成集群，所述交联的dna序列由于分析物核酸序列的扩增而存在。p点集群容易被成像以检测交联dna序列的存在。为了显示探针间杂交，使用宽视野荧光显微镜进行单颗粒成像，如下所述。405nm二极管激光用作激发源。在样品平面上观察到高斯激光曲线，其半高全宽为54μm。使用功率计估算激光点中心的激发功率密度为～100w/cm2。将p点-dna探针固定在载玻片上，并使用10hz的帧频成像。来自三种不同颜色的p点的荧光发射分别通过455±50nm、550±60nm、650±50nm带通滤波器过滤。使用每次计数具有0.48个电子的增益因子的cmos相机(hamamatsu，orca-flash4.0)作为检测器。在对照样品中，将三种颜色的p点-dna探针(0.1ppm浓度)在不存在交联dna的pbs缓冲液中混合，因此，它们没有以比随机机会更高的速率共定位(图13顶行，标题为“对照”)。在由于分析物dna分子的扩增而产生的交联dna(序列：dna5’-acatgtattacactactaaccggtttcgacatgtattacac-3’)的存在下，三种颜色的p点-dna探针(浓度为0.1ppm)以非常高的速率共定位(图13底行，标题为“交联”)。在合并的图像中，使用圆圈强调共定位的p点-dna探针或事件，以指示在相同位置的所有三个颜色通道中均显示信号的集群。因此，可以容易地检测到探针间杂交的存在，并将其用作多路复用数字pcr的简单读出。作为探针间杂交为多路复用数字pcr提供的灵活性的另外说明，我们还进行了使用p点-dna的多对探针间杂交的实验。所有实验条件均与先前描述的相同，但是这里不是使用单个dna序列引起三种不同颜色的p点-dna探针的探针间杂交(图13)，我们设计了需要独特的核酸序列以交联的每对p点-dna探针。该实验表明，只有在靶核酸序列存在的情况下，p点-dna探针的每个成对组合才变得交联(具体地：p点450和p点610探针通过5’-acatgtattacacacatgtattacac-3’交联；p点450和p点540探针通过5’-acatgtattacactactaaccggtttcg-3’交联；p点540和p点610探针通过dna5’-tactaaccggtttcgacatgtattacac-3’交联)，所述靶核酸序列是由于存在的分析物核酸分子的扩增而产生的。这些图像(图14)显示了每个颜色通道和合并图像中的共定位。在分开的对照实验中，类似于图13对照，成对的p点-dna探针在靶核酸序列不存在的情况下不共定位。实施例17用于改变空间解链曲线分析的sd芯片温度的方法该实施例提供了用于控制用于空间解链曲线分析的sd芯片的温度的示例性方法。用包含pcr试剂、evagreen荧光团、序列特异性引物和靶模板的样品对sd芯片装置数字化，所述靶模板浓度为一些孔中将包含靶模板分子，而一些孔中将不包含靶模板分子。将sd装置在95℃和58℃之间进行40个循环的扩增，此后将sd芯片放置在加热元件上，并将温度调节到几个不同的点。使用热红外传感器测量装置表面温度，然后使用led泛光照明在470nm处成像，并通过配备525/25nm带通发射滤波器的相机检测。在约39℃、55℃和72℃的红外温度读数下拍摄图像(图15)。使用线扫描仪进一步分析处理的图像，以检测作为温度的函数的信号变化(图15d)。作为另一个实例，图16a显示了从23℃(顶部)到39℃(从顶部开始第二个)、50℃(中间)、52℃(从底部开始第二个)和73℃(底部)的数字pcr扩增之后sd芯片的温度曲线。使用线扫描来分析图像以量化作为温度的函数的信号变化(图16b)。尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅通过实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变化、改变和替代方式。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种供选择的方案可以用于实施本发明。意图是以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等价方案的范围内的方法和结构。当前第1页12