一种图案化的实现方法及其应用与流程

1.本发明涉及质谱检测领域，具体涉及一种图案化的实现方法及其应用。背景技术：2.图案化作为实现基底材料不同功能区域划分的重要手段，在微纳加工、传感检测、生命科学等众多领域，有着广泛的应用需求。目前，实现图案化主要是通过掩模板，利用磁控溅射、化学/物理气相沉积(cvd/pvd)、蒸镀、刻蚀、光刻等方式实现的。其中磁控溅射、cvd/pvd、蒸镀等方法，虽然能够实现精细的图案和结构，但对所用材料及设备都有较为有严格的要求，而刻蚀的表面粗糙，不利于后续的进一步修饰和改造；相比之下，普通微米级光刻对于材料和设备的要求较低，更容易实现。而在生物技术、生命科学等领域，绝大部分分散相为水相，因此，亲疏水差异是实现图案化最为简单的方式之一，通过设计亲疏水点阵图案，可以多重检验、多重反应等，大大提高其通量。因此，现有技术中，光刻经常与亲疏水点阵联用实现图案化。3.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，maldi-tof ms)打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究。近十年，基于maldi-tof ms的核酸质谱技术作为一种高通量、高灵敏度、准确便捷的技术已成为妇产科、儿科、遗传科、心血管内科、肿瘤科、检验科等多个科室进行核酸检测的主流手段之一，被广泛应用于遗传性疾病筛查、癌症精准分析、药物基因组学检测、病原体检测等领域。在maldi检测中，需要将样品和基质的混合溶液一起沉积在样品靶上，室温下自然干燥、结晶，再将样品靶送入质谱仪中进行检测，其通过亲疏水图案的制备，可以实现在一块基底材料上，96人份或者384人份，甚至更多人份的同时检测，大大提高其检测通量和检测内容，在此过程中，样品在样品靶上沉积面积的大小，样品与基质在样品靶上共结晶的均匀性，都会直接地影响质谱检测的结果。因此，利用合适的方式来调控样品靶表面的性质，对于精准调控的样品沉积面积以及改善样品与基质共结晶的均匀性至关重要，但目前，亲水或者疏水图案化方法，通常由纳米颗粒、金属/聚合物薄膜等构成，在应对复杂的溶液体系时，其亲水/疏水性会遭到破坏，结晶存在缺陷、不平整、不完整和不饱满等问题，且长期稳定性也存在一定风险。技术实现要素：4.为了解决上述亲疏水结构不稳定、实现成本昂贵、工艺复杂、结晶效果差等问题，我们提出了在基材上制备亲疏水图案的方法。5.本发明一方面公开了一种在基材上制备亲疏水图案的方法，其步骤为：6.s1，提供基材；7.s2，将步骤s1选取的基材用乙醇、丙酮或异丙醇处理，处理完成后清洗并吹干；8.s3，将步骤s2中的基材底进行亲水化处理并吹干；9.s4，在步骤s3得到的基材上均匀旋涂光刻胶；10.s5，将光刻掩模版置于步骤s4得到的基材上，再进行紫外曝光，将曝光后的基材浸泡于显影液中显影，完成后吹干；11.s6，将s5得到基材进行疏水处理，完成后置于甲醇、乙醇或丙酮溶剂中，得到亲疏水图案；12.所述疏水处理为将疏水试剂溶于有机溶剂中形成疏水处理试剂，然后将上述基材浸没于所述疏水处理试剂；浸没后，在纯的疏水处理试剂中超声清洗，然后吹干。13.另一方面，发明一方面公开了一种在基材上制备亲疏水图案的方法，其步骤为：14.s1，提供基材；15.s2，将步骤s1选取的基材用乙醇、丙酮或异丙醇处理，处理完成后清洗并吹干；16.s3，将步骤s2中的基材底进行亲水化处理并吹干；17.s4，将s3得到基材进行疏水处理；18.s4，在步骤s4得到的基材上均匀旋涂光刻胶；19.s5，将光刻掩模版置于步骤s4得到的基材上，再进行紫外曝光，将曝光后的基材浸泡于显影液中显影，完成后吹干；20.s6，将s5得到的基材置于甲醇、乙醇或丙酮溶剂中，得到亲疏水图案；21.所述疏水处理为将疏水试剂溶于有机溶剂中形成疏水处理试剂，然后将上述基材浸没于所述疏水处理试剂；浸没后，在纯的疏水处理试剂中超声清洗，然后吹干。22.所述浸没时间1小时以上，本发明所述“浸没”：指疏水处理试剂完全没过基材。23.优选的，疏水试剂为长链烷基硅烷或者含氟硅烷，所述长链烷基硅烷或者含氟硅烷选自十八烷基三氯硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷。24.本发明有机溶剂无特别限制，所述有机溶剂用于溶解硅烷，但不溶解光刻胶，所以优选低极性溶剂，本发明所述低极性是指极性低于甲醇。25.优选的，二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、四氯化碳或二硫化碳。26.所述有机溶剂为含有氯取代的烷烃效果更佳。27.更优选的，选自二氯甲烷、三氯甲烷或二氯乙烷。28.优选的，旋涂条件为100-3000rpm，1s以上。29.优选的，所述旋涂优选分阶段旋涂，更优选的的初始转速100-500rpm，1s-1min，然后1000-2000rpm，10s-1min。30.优选的，所述掩模版图案的尺寸和间距可以按需调整，优先为直径500um，间距96人份的是2.25mm，384人份是1.125mm。31.优选的，所述基材选自表面光滑的材料，所述光滑为表面粗糙程度为ra≤1um，优选为ra≤100nm，更优选为ra≤10nm。32.本发明所述光滑的材料是指表面粗糙程度ra≤1um的基材，因为下游是通过基质预埋之后看基质的形貌来判断好坏，基材表面不光滑，会出现基质结晶不平整、出现大块或者咖啡环效应等。33.本发明对材料并无特殊的需求，只需要表面光滑即可。34.优选的，所述基材选自选自单晶硅、硅片、不锈钢、其他金属、玻璃、塑料等材质，更优选为单晶硅。35.优选的，所述亲水化化处理为：氧气/空气等离子体或piranha溶液对基材表面进行处理。36.所述氧气/空气等离子体对基材表面进行处理，处理1s以上，处理完成后，在纯水中浸泡1min以上；37.所述piranha溶液为浓硫酸双氧水溶液按3:1～7:1混合的溶液，处理1min以上，优选的，可以选择同时进行加热，加热条件为：80～100℃加热10～30min。38.优选的，所述旋涂光刻胶为负胶。39.本发明疏水处理的过程，不含有任何醇类、酮类等，此过程需要保留胶，醇类和酮类会导致去胶，影响亲疏水图案的有效形成。40.优选的，所述有机溶剂为含有氯取代的烷烃效果更佳。41.另一方面，本发明公开了所述基材在核酸质谱中的应用。42.另一方面，本发明提供一种质谱用芯片，所述芯片含有基质和上述基材，所述基质包括：羟基吡啶甲酸与柠檬酸氢铵。43.另一方面，本发明公开了本发明公开了一种疏水处理试剂在核酸质谱中的应用，所述试剂包含长链烷基硅烷或者含氟硅烷和有机溶剂，所述长链烷基硅烷或者含氟硅烷选自十八烷基三氯硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷或十七氟癸基三甲氧基硅烷，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷、四氯化碳或二硫化碳。44.本发明所述吹干为氮气吹干。45.有益效果：46.本发明疏水处理的过程，不含有任何醇类、酮类等，保证疏水图案形成的质量，本发明通过光刻实现图案化，亲疏水部分均通过共价键等强作用力形成的区域，本发明的图案非常精细，可以随意的刻画需要的图案，操作过程中不会产生脱胶、污染等问题。且经过后续的处理或者应用到质谱中与检测溶液进行反应，也不会破坏图案，同时制备方法简单快捷，仅通过溶液浸泡等简单操作即可实现，结晶饱满平整。附图说明47.图1为本发明方法结晶图；48.图2为本发明方法检测应用图；49.图3为本发明方法更换基材结晶图，3a(不锈钢)、3b(玻璃)、3c(塑料)、3d(铁板)。50.图4为本发明方法更换亲水处理结晶图；51.图5为本发明方法跟换疏水试剂结晶图，5a(十六烷基三甲氧基硅烷),5b(十七氟癸基三甲氧基硅烷)；52.图6为本发明方法跟换有机溶剂结晶图，6a(三氯甲烷),6b(二氯乙烷)，6c(四氯化碳)、6d(二硫化碳)；53.图7为对比实施例1方法结晶图；54.图8为对比实施例1检测应用图；55.图9为对比实施例2方法结晶图；56.图10为对比实施例3方法结晶图。具体实施方式57.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的实施例作详细说明。58.下面通过实施例进一步阐明本发明方法及应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。59.本发明通过光刻实现图案化，亲疏水部分均通过共价键等强作用力形成的区域，实现在复杂溶液的情况下，保持亲疏水区域的稳定性，保证最后检测结晶的平整性。60.实施例1本发明基材处理方法61.具体操作如下：62.s1：选用单晶硅片；63.s2：将步骤s1选取的基材用乙醇处理，处理完成后纯净水清洗并吹干；64.s3：将步骤s2中的基材底使用氧气/空气等离子体，对基材表面进行处理(300w的等离子体清洗机，通空气，1mi n)，处理完成后，在纯净水中浸泡5s；65.s4：在步骤s3得到的基材上均匀旋涂光刻胶，旋涂条件为(比如初始转速500rpm，10s，然后2000rpm，30s)；66.s5：将光刻掩模版置于步骤s4得到的基材上，其中掩模版图案的直径为500um，间距为2.25mm再进行紫外曝光，其曝光时间为30s；将曝光后的基材浸泡于显影液中显影，得到图案；67.s6：将s5得到基材进行疏水处理，具体为将十八烷基三氯硅烷溶于二氯甲烷中形成疏水处理试剂，配制成1％v/v的浓度；然后将基材浸没于疏水处理试剂中1h；浸泡完成后，在纯的疏水处理试剂中，超声清洗，然后吹干；完成后置于100％甲醇中，得到亲疏水图案；68.s7：基质覆盖于基材的亲水区域，形成100μm的结晶区，制备芯片。69.s8：将s7中的芯片置于质谱仪离子源的真空环境下，通过激光照射样本与基质之间形成的结晶，产生带电粒子，带电粒子在电场的作用下可以计算飞行时间。70.本实施例所用质谱仪为中元汇吉生物技术股份有限公司的exs3000质谱仪。71.本实施例所用纯净水为市场购买的哇哈哈纯净水。72.a、结晶检测73.结果如图1所示，结果显示，本发明的方法结晶饱满。74.b、检测应用75.利用上述芯片检测耳聋基因20个位点：76.gjb2基因上的rs80338943(235delc)、rs750188782(176_191del16)、rs111033204(299300delat)、rs80338939(35delg)4个snp突变位点；77.gjb3基因上的：rs74315318(547g＞a)和rs74315319(538c＞t)2个snp突变位点；78.slc26a4基因上的rs111033220(1229c＞t)、rs201562855(1174a＞t)、rs111033305(1226g＞a)、rs200455203(1975g＞c)、rs111033318(2027t＞a)、rs121908363(2162c＞t)、rs121908362(2168a＞g)、rs1057516953(281c＞t)、rs111033380(589g＞a)、rs192366176(ivs15+5g＞a)、rs111033313(ivs7-2a＞g)11个snp突变位点；79.12s rrna基因上的rs267606617(1555a＞g)、rs267606619(1494c＞t)和rs267606618(1095t＞c)3个snp突变位点。80.具体操作如下：81.s1：样品dna的提取；82.s2：多重pcr反应；83.s3：磷酸酶消化处理；84.s4：单碱基延伸反应85.s5：树脂脱盐处理；86.s6：利用移液器或者点样仪将反应产物转移至检测芯片，使用重庆中元汇吉生物技术有限公司的maldi-tof exs3000质谱仪进行检测。87.多重pcr反应的引物如下：[0088][0089][0090]单碱基延伸反应的引物如下：[0091]编号序列位点名称seq-id-no.23ctccacagtcaagca1975g》cseq-id-no.24gcctttgggatcagc1174a》tseq-id-no.25caccactgctctttccc1226g》aseq-id-no.26agaaccttaccacccgc2027t》aseq-id-no.27acatccggctatgggcc235delcseq-id-no.28gcagtagcaattatcgtcivs7-2a》gseq-id-no.29cgtacacaccgcccgtcac1494c》tseq-id-no.30cgtggactgctacattgcc538c》tseq-id-no.31gtcatttcgggagttagta281c》tseq-id-no.32cagtgctctcctggacggcc1229c》tseq-id-no.33tgcacgtggcctaccggagac299_300delatseq-id-no.34ggattagataccccactatgct1095t》cseq-id-no.35tctgtagatagagtatagcatca2168a》gseq-id-no.36gatggggaagtagtgatcgtagc176_191del16seq-id-no.37tgccagtgccctgactctgctggtt589g》aseq-id-no.38acccctacgcatttatatagaggag1555a》gseq-id-no.39aaaaaatgtatcaagtccacagtaaivs15+5g》aseq-id-no.40gggcacgctgcagacgatcctggggg35delgseq-id-no.41ccatgaagtaggtgaagattttcttct547g》aseq-id-no.42aaaggacacattctttttga2162c》t[0092]结果如图2所示，结果显示，本发明分辨率高，能够完整检测所有突变。[0093]实施例2本发明基材处理方法条件更换效果[0094]a、跟换基材[0095]按照实施例1中步骤处理，更换基材为：不锈钢、其他金属、玻璃、塑料，结果如图3a(不锈钢)、3b(玻璃)、3c(塑料)、3d(铁板)，结果显示，本发明更换基材以后结晶形态不会受到影响。[0096]b、更换亲水化处理步骤[0097]将实施例1中s3更换为：[0098]s3：使用piranha溶液进行处理(浓硫酸双氧水溶液按3：1混合的溶液，处理20min，90℃，加热10min)处理结果如图4所示，结果显示，本发明更换亲水化处理步骤结晶形态不会受到影响。[0099]c、更换疏水处理试剂[0100](1)按照实施例1中步骤处理，更换疏水试剂为十六烷基三甲氧基硅烷、十七氟癸基三甲氧基硅烷，结果如5a(十六烷基三甲氧基硅烷),5b(十七氟癸基三甲氧基硅烷)，结果显示，本发明更换疏水试剂结晶形态不会受到影响。[0101](2)按照实施例1中步骤处理，更换有机溶剂为三氯甲烷、二氯乙烷、四氯化碳、二硫化碳，结果如6a(三氯甲烷),6b(二氯乙烷)，6c(四氯化碳)、6d(二硫化碳)，结果显示，本发明更换疏水试剂结晶形态不会受到影响[0102]对比实施例1[0103]具体操作如下：[0104]本实施例【不采用光刻，采用不锈钢掩膜】[0105]s1：选用单晶硅片；[0106]s2：将步骤s1选取的基材用乙醇处理，处理完成后纯净水清洗并吹干；[0107]s3：将步骤s2中的基材底使用氧气/空气等离子体，对基材表面进行处理(300w的等离子体清洗机，通空气，1min)，处理完成后，在纯净水中浸泡5s；[0108]s4：在步骤s3得到的基材上均匀旋涂光刻胶，旋涂条件为(比如初始转速500rpm，10s，然后2000rpm30s)；[0109]s5：将不锈钢掩模版背部涂胶(任意常用胶粘剂)，然后将不锈钢掩膜与基材粘结；[0110]s6：将上述基材浸泡入疏水试剂中，具体为将十八烷基三氯硅烷溶于二氯甲烷中形成疏水处理试剂，配制成1％v/v的浓度；然后将基材浸没于疏水处理试剂中1h；浸泡完成后，在纯的疏水处理试剂中，超声清洗，然后吹干，完成后置于100％甲醇中，得到亲疏水图案；[0111]s7：用适当丙酮将胶粘剂溶解，去除不锈钢模板；然后再将基底浸入丙酮中，浸泡5min，超声2min，重复多次，直至胶粘剂被完全去除，得到疏水点阵的靶板；[0112]a、结晶检测[0113]结果如图7所示，结果显示，结晶不平整。[0114]b、检测应用[0115]操作方法与实施例1中检测应用一致[0116]结果如图8所示，结果显示，实施例3基材处理方法分辨率低，不能完整检测所有突变。[0117]对比实施例2[0118]本实施例不采用光刻，采用不锈钢掩膜，同时采用镀膜的方式(ptfe)疏水[0119]s1：选用单晶硅片；[0120]s2：将步骤s1选取的基材用乙醇处理，处理完成后纯净水清洗并吹干；[0121]s3：将步骤s2中的基材底使用氧气/空气等离子体，对基材表面进行处理(300w的等离子体清洗机，通空气，1min)，处理完成后，在纯净水中浸泡5s；[0122]s4：ptff(聚四氟乙烯)超疏水涂层制备：[0123]溶液配制：将ptfe浓缩液(商品，60％wt浓度)与纯水配成ptfe分散液(10％-40％wt)，用磁力搅拌或者机械搅拌，将分散液搅拌均匀；[0124]旋涂：用滴管将上述旋涂液滴于基底上(4寸片，滴入0.5ml-2ml)，在旋涂机上，先预涂，500rpm，30s；然后再以1000-5000rpm/min旋涂60s；[0125]烘干：在烘箱中，以80°，烘烤20min后取出，得到ptfe涂层；[0126]s5：将不锈钢掩模版与硅片用夹具夹紧，至于等离子体清洗机中，50w-500w功率，处理1min-60min；取出，得到亲疏水点阵[0127]本方案稳定性不好，ptfe膜容易脱落[0128]结果如图9所示[0129]结果显示，结晶不平整且不完整。[0130]对比实施例3[0131]本实施例采用光刻，疏水采用纳米结构[0132]具体操作如下：[0133]s1：选取单晶硅作为基材；[0134]s2：将单晶硅基材先后放入丙酮、氯仿、乙醇、超纯水中分别超声清洗，取出基底干燥；[0135]s3：将干燥后的基底利用o2-plasma以200w的功率，处理10min，进行亲水化处理，用水冲洗，氮气吹干；s4：在基底上均匀旋涂正型光刻胶，旋涂的条件为500～5000转/秒，时间为5～50s；[0136]s5：将光刻掩模版置于上述基底上，其中掩模版图案的尺寸为100～2000μm，间距为500～5000μm，置于紫外灯下进行曝光，曝光时间为2～300s；将曝光后的基底放入显影液中显影，随后取出基底，氮气吹干，即可获得光刻胶点阵；[0137]s6：对将基底放入h2so4:h2o2＝3:1的混合溶液中，100℃下加热10min进行亲水化处理，随后在亲水化处理的基底上沉积上银纳米粒子，将获得的基底进行湿法刻蚀，刻蚀时间1～30min，随后将基底进行清洗，氮气吹干，即可在基底上制备出纳米结构；[0138]s7：将聚四氟乙烯分散在乙醇溶液中形成分散液，随后将分散液喷涂于基底上，并将基底加热至100～200℃以除去溶剂，使得基底表面具备疏水性。随后将基底进行清洗，除去光刻胶，氮气吹干，即可在基底上制备出中间是亲水的裸硅区域，周围是纳米结构的超疏水区域。[0139]s8：基质覆盖于基材的亲水区域，形成100μm的结晶区，制备芯片。[0140]s9：将s8中的芯片置于质谱仪离子源的真空环境下，通过激光照射样本与基质之间形成的结晶，产生带电粒子，带电粒子在电场的作用下可以计算飞行时间。[0141]本实施例所用质谱仪为中元汇吉生物技术股份有限公司的exs3000质谱仪。[0142]本实施例所用纯净水为市场购买的哇哈哈纯净水。[0143]结晶检测[0144]结果如图10所示，结果显示，结晶不平整。