基因检测方法及其装置的制作方法

专利名称：基因检测方法及其装置的制作方法技术领域：本发明涉及检测基因如DNA或RNA的方法及其装置，特别是涉及一种使用荧光探针定量、快速检测基因的方法及其装置。为诊断遗传性疾病而合成了一个互补于致病基因的DNA用作DNA探针。具体地说，是将样品基因固定在纤维素滤膜或尼龙滤膜上，再加上放射性标记或染料标记的DNA探针，使之与滤膜上的DNA杂交。然后冲洗滤膜，以除去未与样品基因杂交的DNA探针。由于放射性核素标记或染料标记的DNA可选择地结合在如上得到的固定有基因的滤膜上，故可通过放射自显影或肉眼可见的检测法来判定是否存在可能的致病基因。“Bunseki(Analysis)”(462-468，1986)中描述了这一常规技术。上述常规技术费工费时，而且存在着检测结果定量上的问题。本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，并提供一种能在短时间内简便而又定量地检测基因的方法及其装置。为了达到上述目的，可用荧光素标记与被检基因互补的DNA探针;将样品基因与所说的DNA探针混合并使所说的待检基因与探针杂交;用凝胶电泳法将与所说的待检基因杂交的DNA探针同未与待检基因杂交的游离DNA探针分开，从而使所说的游离DNA探针流进与所说的凝胶下游端接触的缓冲溶液中，并使所说的杂交的DNA探针留在所说的凝胶中;然后用光学方法检测所说的凝胶，以检出荧光标记之杂交的DNA探针。因此，本发明的基因检测方法包括Ⅰ)使样品基因与互补于被检基因并用荧光素标记的DNA探针混合以进行杂交，从而形成杂交DNA探针和游离DNA探针的混合物;Ⅱ)将所说的混合物从所说凝胶的一端注入电泳凝胶中;Ⅲ)用电泳法将所说已杂交的DNA探针与所说的游离DNA探针分离开，从而使所说的游离DNA探针流进与所说的凝胶之下游端相接触的缓冲溶液中，而只把所说杂交的DNA探针留在所说的凝胶中;Ⅳ)在完成所说的第Ⅲ)步骤之后，将所说的凝胶暴露于激发光下，并测定所产生的荧光。其中术语“凝胶下游端”是指凝胶中DNA迁移的下游。另外，本发明的基因检测装置包括Ⅰ)一个引起荧光标记样品发生电泳凝胶迁移的电泳分离器，使具有短小碱基长度的游离DNA探针流进与所说的凝胶的下游端相接触的缓冲液中;Ⅱ)一个当所说的游离DNA探针流入所说的缓冲液后，使保留在已从所说电泳分离器内除去之所说凝胶中的样品发光的激发光源;Ⅲ)用以检测由所说样品产生之荧光的装置。上述(用于分离的)凝胶一般是聚丙烯酰胺凝胶，但也可使用适于荧光检测型电泳装置的凝胶材料。从缩短检测时间的观点看，迁移方向上的凝胶长度最好是5cm或更短。只要能够去除游离的DNA探针，并使与待检基因杂交的DNA探针留在凝胶内，可尽量缩短凝胶长度。从实际操作出发，现有检测技术中凝胶长度的最低限为10mm。对于凝胶的形状一般没有特殊限制，适用于电泳的凝胶制备形式包括包装在一个园柱形容器内的棒形凝胶(使柱子的纵向与电泳迁移方向一致)、一个使其纵向与电泳迁移方向垂直、并且在凝胶迁移方向的上部分带有许多可注入样品之槽的多角棱柱或板状凝胶、或以二维形式在表面上带有许多可注入样品之槽的平板。通过检测探针发出的荧光，可以确定游离的DNA探针是否已通过电泳凝胶分离流入缓冲液内。如果预先测定好从迁移开始到进行荧光检测的迁移时间，则游离DNA探针即在已测定的迁移时间流入缓冲液内。因此，在这种情况下，可根据需要，在事先定好一段时间后，从电泳分离器内取出凝胶，并暴露于激发光下以测定所产生的荧光。为了使大多数分离凝胶暴露于激发光，可方便地将凝胶移至暴露於激发光的区域，以使凝胶相继地暴露于固定的激发光源下。在这种情况下，也可以固定荧光检测装置。如果凝胶有许多泳道，如带有许多便于注入样品之槽的凝胶，则可以使凝胶的各泳道相继地暴露于该固定的激发光源之下。另一个方法是，可在光源由之通过时使多数排在一个方向上的泳道同时暴露于激发光，并按照垂直于激发光的方向移动凝胶，以用行式感受器(linesensor)检测荧光。根据本发明的上述结构，因使用了荧光标记的探针，而不必使用放素性核素，又因为检测的是结合于凝胶中待检基因上的DNA探针所发出的荧光，故不必将凝胶分离的DNA转移到纤维素滤膜或类似物上，从而也改善了检测效率。图1是根据本发明一个实例用于装填凝胶之容器的平面图。图2是根据本发明的一个实例用于电泳分离之装置的纵向断面图。图3是根据本发明的一个实例用于检测荧光之装置的结构示意图。图4显示DNA碱基长度与在预定之距离上迁移所需迁移时间之间的关系曲线。图5是根据本发明的另一个实例显示平板凝胶暴露于激发光源的透视图。图6是根据本发明的再一个实例所用的装置的图解说明，其中所有槽同时暴露于从凝胶侧面引入的激发光以检测荧光。图7是图解显示根据本发明之再一个实例的平板凝胶。实例1现参考图1至4更加详细地描述本发明。图1显示用于分离的样品容器2及如图2所示的容器支撑装置1上视图。图中，样品容器2排成一列。样品容器2均为内径0.7mm、外径6mm、长度4cm的石英管，且容器支撑装置1是由石英制作的。图2显示用于样品电泳分离之装置25的结构纵剖面示意图。凝胶3装填于固定在支撑装置1上容器2内。凝胶3用的是聚丙烯酰胺。将样品注入凝胶3上部。容器2被浸没于上和下部缓冲液中。容器支撑装置1固定于框架21上，目的是和框架21一起支撑上部缓冲液。当跨经电极5和5′提供电压(一般约50伏/cm)时，DNA样品即由凝胶上面部分向下泳动。DNA的泳动速度依据由碱基数目表示的碱基长度N、电泳的电场强度E、以及温度T而有所不同。图4中显示了有不同长度的单链DNA泳动25mm所用的时间td。曲线17、18和19分别相当于聚丙烯酰胺浓度为2%、4%和6%的凝胶。下文中以百分总单体浓度(重量/体积)(g/ml)来表示聚丙烯酰胺浓度。DNA探针的碱基长度(以碱基数目表示)约为20，而待测DNA为1000或1000以上。最短的碱基长度约为300至400。因此，选用了长度为1000的待测基因片段作为典型例子。在该实例中，容器内的凝胶长度和聚丙烯酰胺凝胶浓度分别为25mm和4%。从凝胶的上部分注入1至2μl含样本基因与荧光标记之DNA探针的混合物以启始电泳迁移。2分钟后DNA探针本身流入下部缓冲液槽内。可通过检测由探针发出的荧光来确定探针的流入。另一方面，与被检基因杂交的DNA仅在30分钟之后通过凝胶部分。因此，施加5分钟电泳电场即仅除去尚未杂交的DNA探针，然后将容器2移向固定于支撑装置上的检测部分。这样，如果测定了游离DNA探针流入缓冲液槽及检测荧光所用的时间，则只要控制电泳迁移时间长于上述迁移时间，即可从样品中除去游离DNA探针。图3中显示了用于检测由已杂交DNA所发射荧光之检测部分的结构示意图。由光源6发出的激发光11(如激光或灯光)从上面进入管状容器2，以照射装填于小室容器内的棒形凝胶。如果凝胶中存在杂交的DNA探针即可观察到荧光20。荧光20经透镜7聚光后穿过滤光器8，而进入光接受装置9，并用检测器10检测。激发光源6是具有适于标记DNA探针之荧光团荧光波长的光源。例如，当荧光团是FITC(荧光素异硫氰酸盐;最大荧光波长515nm)时，应使用输出功率为10mw的氩激光(激发波长488nm)，而当荧光团是TexasRed(最大荧光波长605nm)时，则使用输出功率为0.7mW的氦-氖激光(激发波长543nm)。当然也可结合使用其他光源(如红色氦-氖激光或半导体激光)与荧光团。光接收装置9包括，如一个带有计算机控制显示器(CCD)(用于二维图形的情况下)的图像加强仪，或一个光电倍增管。检测器10包括一检测电路和一个数据处理部分。使固定于支撑装置1并呈线形排列的容器2沿着箭头31指出的方向，通过一自动给进机制移向检测部分进行检测。当然也可以移动包括光源、检测器在内的检测部分，以代替移动容器。实例2上述实例1中，各样品均使用了不同的容器。但如图5所示，也可以使用平板凝胶。在这种情况下，可将样品注入平板凝胶3的各槽内。在由石英制成的凝胶支撑装置13支持的平板凝胶3中制成许多样品槽12。按实施例1中所述的同样方法除去分离出的游离DNA探针，并使样品槽暴露于激发光源6发出的光11下，以检测荧光。按箭头51所示方向移动凝胶3，并检测各样品槽的荧光。图6显示了板状凝胶3暴露于由凝胶侧面方向提供激光11的例子。图6所示的实例中，可同时照射并扫描所有样品槽，通过一高敏感性行式感受器15同时检测得自许多样品槽的信息。图象放大仪与二极管陈列的结合被用作高敏感行式感受器15。图6中，数字6标示一激发光源，13为一凝胶支撑装置、14为一滤光镜系统、16为一数据处理系统，61为一箭头指示凝胶扫描的移动方向。实例3为了处理比上面实例中所述者更大量的样品，也可使用如图7所示的在板状表面上布有槽的凝胶板。在这种情况下，可按图3和5中所示的方法检测各槽的荧光，按图6所示的方法逐行检测，或通过整个表面照射用二维检测仪检测。用光进行整个表面照射，如可使用由透镜系统发出的激光或使用扫描激光。图7中，数字3、12和13分别指示带槽的凝胶平板、样品槽及凝胶支撑装置。凝胶支撑装置13是用石英制成的。上述各实例中，不仅可对由杂交DNA发出的荧光进行定量检测，而且可使检测时间减少到大约15分钟或更短，而现有技术中则需要近一天的时间。上述各实例中，分离和检测是分开进行的。但也可以将这些系统组合在一套装置中。如上所述，可按照本发明在短时间内检测基因，而无须使用放射性核素进行标记，也不必将待检DNA固定于滤膜上。再者，本发明还具有可定量测定荧光强度的优点。权利要求1.一种基因检测方法，其包括下述步骤Ⅰ)制备一荧光标记之、与被检基因互补的DNA探针；Ⅱ)将样品基因与所说的DNA探针混合，以使待检基因与所说的DNA探针杂交；Ⅲ)在凝胶(3)上用电泳方法将与待检基因杂交的DNA探针同游离DNA探针分离开，从而由所说的凝胶(3)中除去所说的游离DNA探针；以及Ⅳ)用光学方法检测已除去了游离DNA探针的所得凝胶(3)，以检测荧光标记并已杂交的DNA探针。2.一种基因检测方法，其包括以下步骤Ⅰ)将样品基因与互补于待测基因并用荧光标记的DNA探针混合并进行杂交，从而形成杂交DNA探针与游离DNA探针的混合物;Ⅱ)将所说的混合物由其一端注入电泳凝胶(3)中;Ⅲ)以电泳方法将所说凝胶(3)中的所说的杂交DNA探针与所说的游离DNA探针分离开，从而使所说的游离DNA探针流入与所说凝胶(3)下游端相接触的缓冲液(4)中，而只使已杂交的DNA探针留在所说的凝胶(3)内;以及Ⅳ)在完成上述步骤Ⅲ)后，使所说的凝胶(3)暴露于激发光(11)并检测所产生的荧光(20)。3.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。4.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说步骤Ⅲ)中的迁移时间定义为预先确定的足以使所说的游离DNA探针流入所说缓冲液(4)中的时间。5.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说凝胶的长度为5cm或短于5cm。6.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说的凝胶(3)被装在园柱形样品容器(2)内。7.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说的凝胶(3)在其上表面带有许多用于注射样品的槽。8.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说的凝胶(3)是平板状的，且在其上表面上有许多以二维形式注射样品的槽。9.根据权利要求2的基因检测方法，其中步骤Ⅲ)所说的电泳分离是在许多泳道上进行的，且所说步骤Ⅳ)中荧光(20)的检测是随着将各泳道移向暴露于激发光(11)的区域而连续进行的。10.根据权利要求2的基因检测方法，其中所说的步骤Ⅲ)所说的电泳分离是在带有许多迁移泳道的凝胶上进行的，且所说的步骤Ⅳ)中的荧光检测是使激发光(11)光线由之通过时同时照射按一个方向排列的所说的泳道，并在此同时沿着垂直于激发光的方向(61)移动凝胶，以用行式感受器检测荧光。11.一种基因检测装置，其包括一个用于对荧光标记的样品进行电泳凝胶迁移，以使具有小碱基长度的游离DNA探针流入与所说凝胶(3)之下游端接触的缓冲液(4)中的电泳分离器(25);一个当所说的游离DNA探针流入所说的缓冲液(4)之后，用于激发保留于从所说电泳分离器(25)中除去之所说凝胶(3)内的样品发射荧光的激发光源(6);以及用于检测由所说样品产生之荧光的装置。12.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的凝胶(3)是聚丙烯酰胺凝胶。13.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的凝胶(3)的长度为5cm或短于5cm。14.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的凝胶(3)被装在一园柱形样品容器(2)内。15.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的凝胶(3)在其上表面带有许多使用于注射样品的槽。16.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的凝胶(3)是平板状的，且在其上表面上有许多便于以二维形式注射样品的槽。17.根据权利要求11的基因检测装置，其进一步包括一个使由所说电泳分离器(25)中取出之至少一片所说凝胶(3)的许多迁移泳道连续地移向暴露於激发光的区域的机械装置。18.根据权利要求11的基因检测装置，其中所说的激发光源(6)被置于能够使位于所说凝胶之一个方向上的许多迁移泳道同时暴露于光源的位置上，且具有能以垂直于所说激发光(11)的方向(61)移动所说凝胶的装置，而所说用于检测荧光的装置装有一行式感受器。全文摘要本发明的基因检测方法包括以下步骤使样品基因与互补于待检基因并用荧用标记的DNA探针混合并进行杂交，从而形成杂交DNA探针与游离DNA探针的混合物；将所说的混合物由所说凝胶的一端注入电泳凝胶中；用电泳法将已杂交的DNA探针与游离的DNA探针分离开，从而使游离的DNA探针流入缓冲溶液内；使已经除去了游离DNA探针的凝胶暴露于激发光下并检测所产生的荧光。因此，相对于现有技术，本发明的基因检测方法和其装置能够获得定量的结果，并可显著地缩短检测时间。文档编号F04B39/00GK1038499SQ8810528公开日1990年1月3日 申请日期1988年6月5日 优先权日1988年6月5日发明者神原秀记 申请人:株式会社日立制作所