来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体的制作方法

本发明涉及可用于在啮齿类动物中产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，及所述转基因动物的制备方法。本发明还涉及使用来自细菌人工染色体上被修饰的大区域的多核苷酸及其组合的串联整合来产生人源化和全人抗体的组合物和方法。独立获得的转基因动物的杂交育种允许使用许多不同的、可能全部的人vh、d和jh区段表达高度多样化的人抗体库。通过统一调节单独的整合位点来体内管控表达，以例如获得vh基因多样性和选择而不受干扰。

背景技术：

1、人单克隆抗体(呈具有常规大小的igg、单链或结构域模块的形式)已被证明在治疗应用中极为有用(chan和carter nature reviews.immunology 10，301-316(2010)；enever等，current opinion in biotechnology 20，405-411(2009))。尽管取得了成功，但所述人单克隆抗体的产生仍然存在重大缺陷，其产生要么依赖于对可用人类材料的特异性选择和后续对单个产品的修饰，要么依赖于对有限可用的转基因动物的免疫化(brüggemann等，第i部分：selecting and shaping the antibody molecule，selectionstrategies iii:transgenic mice，in handbook of therapeutic antibodies.ed.dübel，s.wiley-vhc，69-93(2007))。

2、人免疫球蛋白(ig)基因在转基因动物中的dna重排和表达是20多年前通过在种系构型中稳定地插入重链基因而开创的(bruggemann，m.pnas 86，6709-6713(1989))。与非人免疫球蛋白的治疗应用相关的一个问题是所述非人免疫球蛋白在人类患者中具有潜在免疫原性。为了降低此类制剂的免疫原性，已经开发出了各种用于产生嵌合抗体、部分人抗体(人源化抗体)和全人抗体的策略。嵌合抗体包含人恒定区和由非人v基因编码的结合区。在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体的能力是特别理想的，因为抗原结合决定簇位于独特型区域内，并且非人独特型被视为有助于当前抗体治疗剂的免疫原性。就单克隆抗体治疗剂而言，人类独特型是一种特别重要的考虑因素，所述单克隆抗体治疗剂由以相对高的浓度递送的单一独特型组成，而不是由通过多克隆抗体混合物以较低浓度递送的多种独特型组成。

3、使得人ig的表达水平提高和排他性产生的主要改进措施结合了以下两种新的策略：胚胎干(es)细胞中的基因敲除(kitamura等，nature 350，423-426(1991))和人工染色体上的基因座延伸(davies等，nucleic acids research 21，767-768(1993))。在es细胞中通过基因打靶使内源性ig基因沉默产生了几种无活性的小鼠品系，所述失活的小鼠品系无法重排它们的igh和igl基因座，或者不产生全功能的igh、igk或igl产物。最近，锌指核酸酶(zfn)被设计成在ig基因中产生位点特异性双链断裂，这允许通过缺失和非同源dna修复来破坏基因。将zfn质粒注入受精卵中产生具有igh和igl破坏的ig沉默型大鼠和兔(geurts，a.m.等，science 325，433(2009)；menoret，s.等，european journal of immunology 40，2932-2941(2010)；flisikowska，t.等，plos one 6，e21045(2011))。

4、在非人动物中产生人源化转基因抗体的许多现有技术方法遇到的一个重大技术挑战涉及同一动物中重复ig基因座之间的明显竞争，例如，现有或内源性ig基因座和引入转基因动物中的外源性或人工基因座。历史上，在不存在有效敲除的情况下，就抗体产生而言内源性基因座竞争超越了外源性基因座，使得重复基因座得到有效沉默(lonberg等，natbio，23，1117，2005；nicholson等，j immunol，163，6898，1999；brüggemann等，aite 63，101，2015)。因此，就此而言，现有技术没有说明或解决整合在不同染色体位点的重复ig基因座在同一宿主动物中的转基因抗体产生中是否可以协同地起作用，并且事实上将会合理地向本领域技术人员暗示事实正好相反。

5、在非人动物中产生具有人独特型的转基因抗体遇到的另一个技术挑战是难以提供用于产生人抗体的人免疫球蛋白vdj或vj基因区段的完整补体。一些人已经尝试通过从人重链和κ轻链基因座引入兆碱基大小的片段来解决这个问题。然而，这种方法仅在约80％的包含在种系构型中的人免疫球蛋白基因的情况下被证实是成功的，并且依赖于使用原生质体来用酵母人工染色体(yac)系统递送相关染色体的大片段(us 5,939,598)。

6、尽管为了最大限度地提高抗体多样性，已经在转基因动物中利用了广泛重叠的vhd jh区的整合，所述整合使得能够例如维持igh基因座的全部功能并且对于dna重排而言是必需的，但是对重叠整合的报道主要见于小得多的区域(<100kb)(wagner等，genomics35，405-414(1996)；bruggemann等，european journal of immunology 21，1323-1326(1991))或但在单一整合位点仍具有有限库的较大区域(wo2014/093908；bruggemann等)。在提出申请时，本领域的共同理解是，bac或yac混合物的扩散或多重整合较为罕见并且将会对纯合性育种不利。此外，更常见的是将大的yac费力地整合到干细胞中，并且随后从中获得动物(mendez等，nature genetics15，146-156(1997)；davies等，biotechnology(n y)11，911-914(1993))。

7、使用具有人v基因的完整互补序列的转基因动物，优化免疫球蛋白或抗体的产生，从而最大限度地提高具有人独特型的抗体的多样性，对于在广泛的疾病领域中产生对于治疗应用较新颖的特异性仍然是一个挑战。

技术实现思路

1、本发明通过提供包含多个整合在不同的染色体位点的包含重复/重叠人免疫球蛋白vdj或vj基因区段的人工ig重链基因座，并且缺乏产生内源性免疫球蛋白的能力的转基因动物解决了本领域的上述不确定问题。用于产生这些转基因动物的包括在两个不同染色体上的两个不同位置插入两个不同基因座的方法令人惊讶地产生了功能性b细胞，所述方法有利地避免了等位基因排斥，并且由于整合到转基因动物基因组中的人免疫球蛋白vdj重链基因区段的完整互补序列而增加了抗体多样性。

2、在本发明的一个方面，公开了新颖多核苷酸，其包含编码嵌合免疫球蛋白链、特别是用于产生转基因动物的嵌合重链的核酸序列。本发明的多核苷酸有利地提供最佳表达，这至少部分地是由3'增强子的纳入所致，因为缺乏该3'增强子的转基因座导致同种型转换受损和igg表达减少。因此，在优选的实施方案中，本发明提供了嵌合多核苷酸，其包含大鼠3'增强子序列、ig恒定区基因和至少一个人免疫球蛋白(ig)连接(j)区基因。在优选的实施方案中，大鼠3'增强子序列包含如seq id no:1所述的序列或其一部分。

3、在一个实施方案中，本文所述的嵌合多核苷酸可进一步包含至少一个人可变(v)基因、至少一个多样性(d)基因或其组合。在一个实施方案中，嵌合多核苷酸的恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。在一个优选的实施方案中，恒定区基因是大鼠恒定区基因。在另一个优选的实施方案中，恒定区基因选自由cμ和cγ组成的组。

4、在一个实施方案中，嵌合多核苷酸包含与本文公开的细菌人工染色体(bac)annabel(例如，seq id no:10或其一部分)基本上同源的核酸序列，并且可任选地还包含可从bac6-vh3-11和bac3构建体和/或bac9和bac14/5构建体中分离的至少一个人可变ig基因。在一个优选的实施方案中，本文涵盖的嵌合多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人ig可变区，其包含可从bac6-vh3-11和bac3构建体和/或bac9和bac14/5构建体中分离的呈天然构型的人v基因的；和(b)人ig连接区，其包含可从bac annabel中分离的呈天然构型的人j基因。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸的人ig可变区、人ig多样性区、人ig连接区、ig恒定区和大鼠3'增强子区中的每一个均处于如图1a中所示的相对位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如seq id no:2所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如seq id no:11所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸包含重排的v-d-j区，其中所述重排的v-d-j区编码重链可变结构域外显子。

5、在一个实施方案中，转基因动物还包含嵌合多核苷酸，其中所述人ig v区包含可从bac9和/或bac14/5中分离的至少一个人v区基因。在一个优选的实施方案中，嵌合多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人ig可变区，其包含来自bac9和/或bac14/5的以天然构型使用(或重排)的人v区基因；和(b)人ig连接区，其包含来自细菌人工染色体(bac)annabel的以天然构型使用(或重排)的人j区基因。在另一实施方案中，人免疫球蛋白可变区(基因)、人免疫球蛋白多样性区(区段)、人免疫球蛋白连接区(区段)、免疫球蛋白恒定区基因和大鼠3'增强子中的每一个处于如图1b所示的位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如图6中所述的序列或与所述序列基本上同源的序列。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如图7中所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。在另一实施方案中，如本文所公开的嵌合多核苷酸可包含重排的v-d-j，其中所述重排的基因区段来自上述seq id no和图。

6、本文还公开了编码人κ轻链基因的多核苷酸。在一个实施方案中，如本文所公开的多核苷酸具有包含选自由rp11-1156d9(如seq id no:3所述)和rp11-1134e24(如seq idno:4所述)组成的组的核酸序列或与所述核酸序列基本上同源的核酸序列。在另一实施方案中，所分离的多核苷酸以5'至3'顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人ig可变区，其包含可从细菌人工染色体(bac)rp11-156d9和/或rp11-1134e24分离的呈天然构型的人v基因；(b)人ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(bac)rp11-1134e24和/或rp11-344f17(如seq idno:5所述)分离的呈天然构型的人j基因。在一个优选的实施方案中，人ig可变区、人ig连接区和人ig恒定区中的每一个处于如图2所示的相对位置。在另一实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包含如seq id no:6所述的序列或其一部分或与所述序列或其一部分基本上同源的序列。

7、本文还提供了一种啮齿类动物细胞，其包含一种或多种本发明多核苷酸。例如，本文提供了一种啮齿类动物细胞，其包含如本文所公开的多核苷酸，所述多核苷酸优选地包含编码嵌合重链的核酸序列(例如编码大鼠3'增强子序列的核酸序列)、ig恒定区基因和至少一个人j区基因，并且任选地，包含与选自由rp11-1156d9、rp11-1134e24及其一部分组成的组的核酸序列基本上同源的核酸序列。本文所涵盖的啮齿类动物细胞可进一步包含编码功能性轻链的多核苷酸，所述多核苷酸例如具有包含选自由以下组成的组的核酸序列或与所述核酸序列基本上同源的核酸序列：如图2a中所示的序列(如seq id no:6所述)、如图2b中所示的序列(如seq id no:7所述)及其部分。在一个实施方案中，将一种或多种多核苷酸整合至啮齿类动物细胞基因组中。

8、在本发明的另一个方面，提供了一种转基因动物，其包含至少一个失活的内源性ig基因座和多个人工转基因ig重链基因座，所述多个人工转基因ig重链基因座整合在动物基因组中不同的染色体位点。在一个实施方案中，具有多个人工ig重链基因座的转基因动物包含(i)具有至少一个编码种系或超突变的人v区氨基酸序列的人v基因区段的v区；(ii)一个或多个j基因区段；及(iii)一个或多个恒定区基因区段，其中所述人工ig重链基因座是功能性的并且能够发生基因重排并协同地起作用以产生人工免疫球蛋白库。在另一实施方案中，转基因动物包含人可变重链区的完整互补序列。在其它各个实施方案中，转基因动物i)具有包含重叠的重链基因区段的人工重链基因座、ii)缺乏功能性内源性ig轻链基因座和/或iii)缺乏功能性内源性ig重链基因座。在再一实施方案中，转基因动物表达多样化的抗体库，所述抗体由位于不同染色体位点的转基因免疫球蛋白基因座的v基因编码。

9、在一些实施方案中，转基因动物缺乏功能性ig轻链基因座并且能够产生仅重链抗体(heavy chain-only antibody)。

10、在另一实施方案中，具有至少两个人工ig重链基因座的转基因动物的至少一个人工ig重链基因座包含至少一个人免疫球蛋白(ig)连接(j)区基因、ig恒定区基因和大鼠3'增强子。在这些转基因动物中，大鼠3'增强子可包含如seq id no:1所述的序列。在上述实施方案中描述的转基因动物可进一步包含至少一个人ig可变(v)区基因和/或人ig多样性(d)区基因。在本发明的其它实施方案中，恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。在某些实施方案中，恒定区基因包含选自由cμ和cγ组成的组的恒定区基因。在各个实施方案中，转基因动物包含与细菌人工染色体(bac)annabel或其一部分基本上同源的核酸序列。

11、在某些实施方案中，转基因动物的人ig v区包含可从bac6-vh3-11和/或bac3中分离的至少一个人v区基因。在一个特定实施方案中，转基因动物包含以5'至3'的顺序具有以下的核酸：(a)人ig可变区，其包含可从bac6-vh3-11和/或bac3中分离的呈天然构型的人v区基因；和(b)人ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(bac)annabel中分离的呈天然构型的人j区基因。在一个实施方案中，人免疫球蛋白可变区、人免疫球蛋白多样性区、人免疫球蛋白连接区、免疫球蛋白恒定区和大鼠3'增强子中的每一个均处于图1a所示的相对位置。在另一实施方案中，转基因动物具有与如seq id no:2所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在再一实施方案中，转基因动物具有与如seq id no:11所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在一些实施方案中，转基因动物具有v-d-j区，所述v-d-j区经重排并形成编码重链可变结构域的完整外显子。

12、在某些其它实施方案中，转基因动物具有人ig v区，所述ig v区包含可从bac9-vh3-53和/或bac14/5中分离的至少一个人v区基因。在一个特定实施方案中，这些转基因动物包含以5'至3'的顺序具有以下的核酸：(a)人ig可变区，其包含可从bac9-vh3-53和/或bac14/5中分离的呈天然构型的人v区基因；(b)人ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(bac)annabel中分离的呈天然构型的人j区基因。在一个实施方案中，人免疫球蛋白可变区、人免疫球蛋白多样性区、人免疫球蛋白连接区、免疫球蛋白恒定区和大鼠3'增强子中的每一个均处于图1b所示的相对位置。在另一实施方案中，转基因动物具有与图6中所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。在再一实施方案中，转基因动物具有与图7中所述的核酸序列基本上同源的核酸序列。

13、在本发明的另一方面，提供了一种产生抗体的方法，所述方法包括用免疫原对如上所述的转基因动物实施免疫。在一个实施方案中，产生多克隆抗血清组合物，其中所述抗血清包含由位于不同染色体位点的转基因免疫球蛋白基因座编码的v基因编码的抗原特异性抗体。在另一实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；和(iii)使用所述产生单克隆抗体的细胞产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体，或使用所述产生单克隆抗体的细胞产生产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，并使用所述杂交瘤细胞产生所述单克隆抗体。

14、在另一实施方案中，产生单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离编码特异性地结合至所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；和(iv)使用所述单克隆抗体核酸产生所述特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体具有人独特型。

15、在再一实施方案中，产生完全人单克隆抗体的方法包括(i)用免疫原对上述转基因动物实施免疫，(ii)从所述转基因动物中分离产生单克隆抗体的细胞，其中所述产生单克隆抗体的细胞产生特异性地结合至所述免疫原的单克隆抗体；(iii)从所述产生单克隆抗体的细胞中分离编码特异性地结合至所述免疫原的所述单克隆抗体的单克隆抗体核酸；(iv)修饰所述单克隆抗体核酸以产生编码完全人单克隆抗体的重组核酸；和(v)使用所述编码完全人单克隆抗体的重组核酸产生编码的完全人单克隆抗体。

16、本发明的另一方面是通过上述方法产生的单克隆抗体。

17、在另一个方面，提供了一种用于中和人体组分中的抗原实体的方法，其包括使所述身体组分与如上所述的多克隆抗血清组合物接触，其中所述多克隆抗血清组合物包含特异性地结合并中和所述抗原性实体的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，用于中和人体组分中的抗原性实体的方法包括使身体组分与根据上述的单克隆抗体接触，其中所述单克隆抗体特异性地结合并中和所述抗原性实体。