一种来自纤维弧菌的几丁质酶Chi18D及其编码基因与应用

本发明涉及农业生物，具体涉及一种来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d及其编码基因与应用。

背景技术：

1、几丁质是由n-乙酰基-d-葡萄糖胺（glcnac）单元通过β-1，4-糖苷键连接而成，是最丰富的天然氨基多糖，主要存在于甲壳动物外壳和真菌细胞壁中。自然界中的几丁质主要以晶体形式存在，其结构是通过糖链间的乙酰基和氨基形成的氢键作用来稳定。这种难溶和不溶的复杂结构能防止其被有效降解，也限制了其开发和利用。几丁质的衍生物如glcnac、壳聚糖和几丁质寡糖可以应用在医疗、制药、农业、食品、化工和纺织业。此外，几丁质衍生物几丁二糖还具有降血糖作用，可用作开发安全有效的预防和改善糖尿病的保健品。

2、自然界中几丁质不会长期积累，说明存在利用其生长的微生物，进化出有效的酶促系统来降解顽固的结晶几丁质，其中主要起到降解作用的是几丁质酶，几丁质酶在碳水化合物活性酶(cazy)数据库被分为糖苷水解酶gh18和gh19家族，其中细菌来源的几丁质酶大多为gh18家族。gh18家族几丁质酶根据酶促反应模式可分为两类：外切几丁质酶和内切几丁质酶，前者作用于几丁质链的还原端和非还原端持续水解产生几丁二糖，后者随机断裂糖苷键产生几丁寡糖。

3、纤维弧菌是一种强大的多糖降解细菌，其能够利用几丁质作为碳源生长，挖掘其几丁质酶可为几丁质开发利用提供优良的基因和酶资源。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d。

2、本发明的再一目的是提供编码上述几丁质酶chi18d的几丁质酶基因。

3、本发明的再一目的是提供包含上述几丁质酶基因的重组表达载体。

4、本发明的再一目的是提供包含上述几丁质酶基因的重组菌株。

5、本发明的再一目的是提供上述几丁质酶chi18d的应用。

6、本发明的再一目的是提供一种制备几丁质酶的方法。

7、根据本发明的来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d，其氨基酸序列如seq id no:1所示，其中n端28个氨基酸为信号肽，成熟几丁质酶chi18d的氨基酸序列如seq id no:3所示。

8、本发明提供了编码上述来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d的基因。

9、根据本发明的具体实施方式，所述编码上述来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d的基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，其中5’端84bp片段为编码信号肽序列，成熟蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示，编码成熟蛋白的核苷酸序列如seq id no:4所示。

10、根据本发明的制备几丁质酶的方法，包括以下步骤：

11、将编码成熟几丁质酶chi18d的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；

12、将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；

13、提取克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；

14、将重组表达菌株进行甲醇诱导培养，获得几丁质酶发酵液；

15、回收发酵液并纯化所表达的几丁质酶。

16、根据本发明的制备几丁质酶的方法，所述表达菌株为 p. pastoris gs115。

17、本发明提供了一种纤维弧菌几丁质酶chi18d，所述几丁质酶与已公布的来自 streptomyces lividans几丁质酶chitinase 63的序列(蛋白序列登录号: p36909)同一性为49.6%。本发明的几丁质酶chi18d属于糖苷水解酶18家族，其最适温度为60℃，在50℃处理60min，仍能保持83%的酶活力；其最适ph为6，在ph3.0-8.0范围内，该酶能维持80%以上酶活力。该酶具有较好的热稳定性和ph稳定性。大多数几丁质酶只能降解胶体几丁质，能降解粉末几丁质的酶报道较少，且纤维弧菌属尚未有报道能够降解粉末几丁质的几丁质酶，而本申请的几丁质酶还可以直接降解粉末几丁质产生0.31mg/ml的几丁二糖。

技术特征：

1.一种来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d，其特征在于，所述来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d的氨基酸序列如seq id no:1或seq id no:3所示。

2.几丁质酶基因，其特征在于，所述几丁质酶基因编码权利要求1所述的来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d。

3.根据权利要求2所述的几丁质酶基因，其特征在于，所述几丁质酶基因的核苷酸序列如如seq id no:2或seq id no:4所示。

4.包含权利要求2所述几丁质酶基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述几丁质酶基因的重组菌株。

6.权利要求1所述来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d的应用。

7.权利要求1所述来自纤维弧菌的几丁质酶chi18d用于降解几丁质的应用。

8.一种制备几丁质酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

技术总结本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种来自纤维弧菌的几丁质酶Chi18D及其编码基因与应用。所述来自纤维弧菌的几丁质酶Chi18D的氨基酸序列如SEQ ID No:1或SEQ ID No:3所示。该酶的最适温度为60℃，最适pH为6；在50℃和pH3.0~8.0范围内酶活力最高，其酶活力能保持80%以上；该酶可以水解不溶性粉末几丁质，在几丁质降解和几丁质寡糖的制备方面有重要应用价值。技术研发人员：罗会颖,辛颜哲,秦星,张宏海,黄火清,涂涛,王晓璐,田健,王亚茹,张杰,张红莲,柏映国,王苑,于会民,姚斌受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18