双交联可食用生物墨水、其制备方法及其在细胞培育肉制备中的应用与流程

本发明涉及细胞培育肉，尤其涉及双交联可食用生物墨水、其制备方法及其在细胞培育肉制备中的应用。

背景技术：

1、细胞培育肉是通过体外培养细胞制备的与动物肌肉组织的外观、营养、质构和味道高度相似的块状肉，也称生物培育肉、培育肉、清洁肉等。细胞的三维培养能够模拟细胞在体内的生长环境，经三维培养，细胞呈现空间立体生长的状态，有利于在体外构建具有真实质感的肌肉组织，达到肌肉组织的体外塑形和构建的目的。

2、细胞三维培养需要生物相容性较好的生物墨水制备的支架材料。在天然肌肉组织中，细胞外基质作为主要由蛋白质和多糖组成。理想的3d打印生物墨水应具备以下性能：与细胞外基质的结构和功能相似，稳定性好，生物相容性好，可促进细胞在其上粘附、三维生长。但由于蛋白和多糖材料本身生物相容性和稳定性差，细胞无法直接在蛋白和多糖材料上贴附生长，因此现有技术通常将墨水材料和细胞混合后直接打印成产品（例如专利申请cn2021116690280），少有现有技术通过将细胞接种在生物墨水材料中进行粘附、三维生长、增殖，进而呈现出空间立体生长的状态，由细胞自主发育成为块状肉。

3、与将细胞与生物墨水混合进行3d打印并制备细胞培育肉相比，先将生物墨水经3d打印制备为三维支架材料，再接种细胞进行三维培养制备细胞培育肉能够更好地模拟细胞在体内的生长环境，制得细胞培育肉更接近天然肌肉的组织形态和口感。但是，后者对生物墨水的性能要求明显更高，不仅需要生物墨水可3d打印、可食用性，还需要具有更好的生物相容性，能够促进细胞粘附并进行高效的三维生长，同时具有较好的稳定性，在长时间培养过程中保证支架材料形态稳定。

4、明胶是一种生物相容性和稳定性较差的蛋白，为了增强明胶材料的生物相容性和稳定性，通常会使用戊二醛或n,n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺或通过高能辐射（如紫外线）对明胶和壳聚糖材料进行交联，所生成的壳聚糖-明胶交联物是一种应用前景较好的组织工程材料，但未见将其用于细胞培育肉领域的报道。而且，传统的交联方法往往涉及使用有毒试剂，例如戊二醛或光引发剂以及诱变紫外线照射，并导致形成不安全或不完全生物相容的副产物，无法应用于细胞培育肉的生产加工，限制了上述材料在细胞培育肉领域的应用。因此，亟需开发可食用、生物相容性好、稳定性强的新型生物墨水材料用于细胞培育肉领域。

技术实现思路

1、本发明提供双交联可食用生物墨水、其制备方法及其在细胞培育肉制备中的应用。

2、申请人前期开发了可食用3d打印生物墨水并将其用于培育肉制备（专利申请cn115747197a），但是该生物墨水制备的支架材料在用于细胞培养时，细胞贴附时间、生物相容性以及稳定性仍有待提升。为解决上述问题，本发明首先对生物墨水原料组分进行了优化，显著提高了细胞在生物墨水制备支架材料中的增殖效率和立体生长效果以及支架材料的稳定性。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供一种生物墨水，所述生物墨水的原料包括果胶、壳聚糖、谷氨酰胺转氨酶和明胶；

5、其中，所述果胶为高酯果胶。

6、本发明发现，高酯果胶与壳聚糖可以交联形成微凝胶结构，该结构能够在谷氨酰胺转氨酶的作用下与明胶交联形成具有较高强度的双交联网状结构，能够显著提高制得支架材料的稳定性，同时显著提高材料的生物相容性，更好地支持细胞粘附、三维生长，细胞增殖呈现出空间立体生长的状态，且增殖效率显著提高。其中，果胶的酯化度会显著影响其与壳聚糖交联以及后续与明胶双交联形成的凝胶性能，进而影响生物墨水经3d打印制得支架材料的稳定性和生物相容性，影响细胞的增殖效率以及支架材料在培养过程中的形态稳定，使用高酯果胶的效果明显优于低酯果胶。

7、优选地，上述原料中，果胶和壳聚糖的质量比为1：（0.01-0.02）。

8、优选地，上述原料中，果胶和明胶的质量比为1：（1.07-1.60）。

9、将果胶与壳聚糖、明胶的用量配比控制在上述范围内更有利于提高生物墨水的可打印性、生物相容性和机械性能。

10、优选地，上述原料中，谷氨酰胺转氨酶的用量为2200-2500u/g明胶。更优选为2250-2500u/g明胶。将谷氨酰胺转氨酶的用量控制在上述范围内更有利于提升生物墨水制得支架材料在培养基中的稳定性。

11、优选地，所述果胶的酯化度大于68%。更优选为不低于70%。将酯化度控制在上述范围内，更有利于提升生物墨水经3d打印制得支架材料的稳定性以及细胞的贴附率。

12、在满足上述酯化度要求的基础上，本发明对于果胶的来源没有特殊限制，可以选择柑橘、甜菜和苹果等来源的高酯果胶。

13、优选地，所述果胶的分子量为250-350 kda，中性糖与酸性糖的质量比为1：（2-3）。

14、优选地，所述明胶为a型明胶和/或a+b型明胶。使用其他类型的明胶的交联效果较差、甚至无法实现交联。

15、为满足可食用的要求，上述使用的果胶、壳聚糖、明胶和谷氨酰胺转氨酶均为食品级。

16、以上所述的生物墨水的制备方法包括：将果胶的水溶液和壳聚糖的水溶液混合，在ph为5.5-6.0条件下进行一次交联形成微凝胶后，再与谷氨酰胺转氨酶以及明胶的水溶液混合进行二次交联。

17、本发明发现，果胶和壳聚糖在ph为5.5-6.0条件下进行交联能够增加果胶和壳聚糖的交联强度，增加糖分子间的相互接触，促进交联。在该条件下形成的微凝胶再与明胶二次交联制得的凝胶结构更有利于稳定性和生物相容性的提高。

18、果胶的水溶液和壳聚糖的水溶液混合得到的混合溶液的自然ph为4.8-5.0，可采用ph高于上述自然ph的缓冲液调节ph为5.5-6.0。

19、优选地，一次交联的体系中，果胶的浓度为5%-25%，壳聚糖的浓度为0.1%-0.4%。更优选地，果胶的浓度为8%-25%，壳聚糖的浓度为0.15%-0.35%。

20、优选地，二次交联的体系中，明胶的浓度为8%-16%；

21、本发明通过对交联体系中各组分的浓度进行优化确定了上述适宜的浓度范围，其中果胶的浓度高于上述范围，会导致生物墨水粘稠度增加，打印后的材料在培养基中容易溶解崩塌，稳定性较差，果胶浓度低于上述范围，会导致生物墨水交联度降低；壳聚糖的浓度高于上述范围，会导致生物墨水交联度增强，墨水流动性变差，易堵针头，可打印性降低，浓度低于上述范围，会导致支架交联度降低，稳定性变差，且生物相容性降低；明胶的浓度高于上述范围，会导致生物墨水的强度提高，容易造成3d打印针头堵塞，浓度低于上述范围，会导致生物墨水粘稠度降低，可打印性降低，甚至无法打印成型。

22、优选地，二次交联的体系中，谷氨酰胺转氨酶的浓度为1~2%。谷氨酰胺转氨酶浓度高于上述范围，会导致生物墨水交联度过高，无法进行3d打印，浓度低于上述范围，会导致生物墨水交联度过低，墨水稳定性降低，打印材料无法稳定存在于培养基中。

23、本发明制备生物墨水的原料中，果胶还可作为功能性多糖，在体内发挥调节肠道菌群、促进胆固醇代谢的功效，还可根据实际应用需要进一步添加适量的功能性多糖、寡糖类膳食纤维作为功能性膳食纤维进入机体发挥功效。

24、可选地，所述原料还包含功能性膳食纤维，所述功能性膳食纤维与所述果胶的质量比为1：（5-15）。优选为1：（8-10）。

25、所述功能性膳食纤维包括但不限于果葡聚糖、低聚果糖、菊粉。

26、本发明提供的上述生物墨水为用于细胞三维生长以制备细胞培育肉的生物墨水。

27、第二方面，本发明提供以上所述的生物墨水的制备方法，所述方法包括：将果胶的水溶液和壳聚糖的水溶液混合，在ph为5.5-6.0条件下进行一次交联形成微凝胶后，再与谷氨酰胺转氨酶以及明胶的水溶液混合进行二次交联；

28、其中，所述一次交联为在35-38℃孵育10-30min；和/或，所述二次交联为先在20-30 khz条件下超声15-20 min，再在38-42℃条件下孵育50-80 min。

29、优选地，所述方法包括：在反应容器中依次加入果胶的水溶液和壳聚糖的水溶液，混匀后调节ph为5.5-6.0，35-38℃（优选37℃）孵育10-30min进行一次交联形成微凝胶，再将谷氨酰胺转氨酶和明胶的水溶液依次添加至微凝胶中，混匀后先在20-30 khz条件下超声15-20 min，再在38-42℃条件下孵育50-80 min进行二次交联，得到生物墨水。

30、上述方法中，当加入功能性膳食纤维时，可选择在加入果胶的水溶液后，加入壳聚糖的水溶液前添加功能性膳食纤维。

31、在二次交联完成后可直接进行3d打印，打印时无需光引发剂，具体为：将二次交联得到的生物墨水装入针管进行3d打印，对打印好的生物墨水支架材料进行辐照灭菌即可得到制备细胞培育肉所需的生物墨水支架材料。

32、第三方面，本发明提供以上所述的生物墨水的以下任一种应用：

33、（1）在制备用于细胞三维生长的生物支架材料中的应用；

34、（2）在制备细胞培育肉中的应用；

35、（3）在细胞体外培养中的应用。

36、上述（2）中，生物墨水用于制备细胞培育肉制备使用的生物支架材料。

37、上述（3）中，细胞体外培养为细胞体外三维培养。

38、第四方面，本发明提供一种生物支架材料，所述生物支架材料由以上所述的生物墨水经3d打印制备得到。

39、第五方面，本发明提供以上所述的生物支架材料在细胞体外三维培养或细胞培育肉制备中的应用。

40、第六方面，本发明提供一种生物支架材料的制备方法，所述方法包括：将以上所述的生物墨水进行3d打印；

41、所述3d打印的条件为：挤出流速3.50-4.50 mm3/s，打印速度4.50-5.50 mm/s，线间距0.4-0.6 mm。

42、第七方面，本发明提供一种细胞培育肉的制备方法，所述方法包括：将细胞接种于以上所述的生物支架材料中进行培养。

43、上述细胞包括但不限于成肌细胞、肌肉干细胞、肌卫星细胞、肌肉前体细胞等。

44、上述细胞来源包括但不仅限于猪、鸡、牛、羊等哺乳动物。

45、本发明的有益效果至少包括：本发明提供的生物墨水材料解决了现有生物墨水生物相容性差（无法支持细胞立体生长或细胞增殖效率较低、立体生长效果差）、不可食用、可打印性差、无法用于细胞培养物的生产加工等问题，在进行3d打印时无需光引发剂，可食用，具有良好的生物相容性和可打印性，能够较好地支持细胞三维生长，细胞增殖效率高且立体生长效果好，制得生物支架材料稳定性高，可长期在培养基中稳定存在；且兼具调节肠道菌群、促进胆固醇代谢的功效；可在培养皿、转瓶、生物反应器等多种细胞培养装置中进行细胞扩增，用于细胞培育肉的生产加工，在食品科学、细胞农业、生物医疗等领域具有广阔的应用前景。