一种壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及临床检测，具体涉及一种壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、壳多糖酶3样蛋白1是一种分泌型糖蛋白，缩写为chi3l1，分子质量约40kda，研究发现在肝硬化患者的血清中，chi3l1的浓度可显著升高，其在肝脏中富集和特异性表达，可以作为一种高灵敏度高特异性的肝纤维化分期和诊断的血清检测标志物。

2、其临床检测的意义为：作为乙肝和丙肝相关肝纤维化和肝硬化的标志物；作为酒精肝和日本血吸虫肝纤维化和肝硬化的标志物；作为非酒精性脂肪性肝病导致的肝纤维化和肝硬化的标志物；作为抗病毒治疗疗效跟踪和预后的研究。

3、目前检测壳多糖酶3样蛋白1的方法主要有胶体金法、酶联免疫法、磁微粒化学发光法等，这些方法存在测定精度不高，成本较高或测定时间长等缺点。乳胶增强免疫比浊法是一种简便、成本低、通用性强的方法，但现有的chi3l1的乳胶增强免疫比浊法存在胶乳微球团聚体直径不均匀导致的测定结果准确性降低，定时刻读取的参照吸光值不一定是最低值而导致测定结果稳定性降低的问题。

4、因此需要开发一种能够实现胶乳微球团聚颗粒均匀，参照值稳定准确的壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒及其制备方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒及其制备方法，通过在检测试剂中设置两种不同直径、不同修饰区域的负载相应抗体的胶乳微球，控制胶乳微球团聚的直径，从而提高待检体系浊度与待检样品中壳多糖酶3样蛋白1浓度的相关性，增加检测准确性；通过设置带有同样组成但其胶乳微球不经修饰的第三试剂，作为严格参照吸光值，提高检测稳定性。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒，其特征在于，所述壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；

4、所述第一试剂包括抗干扰剂、第一抗氧化剂、第一蛋白稳定剂、第一表面活性剂、无机盐、第一抗菌防腐剂、缓冲液；

5、所述第二试剂包括全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球、单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球、第二抗氧化剂、第二蛋白稳定剂、第二表面活性剂、第二抗菌防腐剂；

6、所述第三试剂包括第一空白胶乳微球、第二空白胶乳微球、第三抗氧化剂、第三蛋白稳定剂、第三表面活性剂、第三抗菌防腐剂；

7、所述全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球是指外表面全部负载所述壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球；

8、所述单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球是指仅一侧球冠对应胶乳微球表面负载所述壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球，所述球冠的高度为胶乳微球直径的25％-35％；

9、所述壳多糖酶3样蛋白1抗体包括分别由壳多糖酶3样蛋白1抗原表位肽a制备得到的第一单克隆抗体和壳多糖酶3样蛋白1抗原表位肽b制备得到的第二单克隆抗体，所述抗原表位肽a的氨基酸序列为yrtgalsagkvsid，所述抗原表位肽b的氨基酸序列为ytksvppflkrta；

10、所述第一试剂的ph为6.6-6.9、第二试剂的ph为7.0-7.2，第三试剂的ph为6.8-7.1。

11、优选地，所述第一单克隆抗体与第二单克隆抗体在所述全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球和单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球上的负载比例为1:2-2:1。

12、优选地，制备所述全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球的空白胶乳微球为第一胶乳微球，制备所述单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球的空白胶乳微球为第二胶乳微球；所述第一胶乳微球和所述第一空白胶乳微球的粒径范围为150-200纳米；所述第二胶乳微球和第二空白胶乳微球的粒径范围为300-400纳米。

13、优选地，所述第一胶乳微球和第二胶乳微球包括羧基聚苯乙烯胶乳微球。

14、优选地，所述抗干扰剂包括抗风湿因子抗体、抗类风湿因子抗体中的至少一种；

15、所述第一抗氧化剂、第二抗氧化剂、第三抗氧化剂包括维生素c、n-乙酰半胱氨酸、巯基甘油、还原型谷胱甘肽中的至少一种；

16、所述第一蛋白稳定剂、第二蛋白稳定剂、第三蛋白稳定剂包括聚乙二醇、聚丙二醇、烷基糖苷、低聚海藻糖、葡聚糖、木聚糖、纤维寡糖中的至少一种；

17、所述第一表面活性剂、第二表面活性剂、第三表面活性剂包括吐温80、吐温60、月桂酰二乙醇胺中的至少一种；

18、所述无机盐包括溴化钠、氯化钠中的至少一种；

19、所述第一抗菌防腐剂、第二抗菌防腐剂、第三抗菌防腐剂包括庆大霉素、叠氮钠中的至少一种；

20、所述缓冲液包括甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液中的至少一种。

21、第二方面，本发明提供一种如上所述壳多糖酶3样蛋白1检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

22、制备全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球：将第一胶乳微球加入mes·h2o 2-4.6g/l，使用氢氧化钠调节ph至6.6-6.7的缓冲液中，混合均匀后加入硼酸2.6-3.2g/l、磷酸氢二钠0.7-1.1g/l，使用氢氧化钠调节ph为7.1-7.5的缓冲液，在25-32℃下混合，得到第一胶乳微球悬浊液；然后将所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体加入所述第一胶乳微球悬浊液中，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体在反应体系中的浓度为780-1380mg/ml，再加入0.06-0.2g/l的edc·hci溶液和0.3-0.7g/l的nhs溶液，在33-36℃下搅拌进行偶联反应，反应时间为6-9h；加入由吐温100-190ml/l和bsa1.1-1.8g/l的封闭液，在29-33℃下搅拌分散，进行3-7h封闭反应；加入proclin300，使其在体系中浓度达到0.3-0.6ml/l，并使用氢氧化钠溶液或者盐酸将ph调节到7.1-7.2，搅拌浸泡12-15h，得到所述全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球；

23、制备单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球：将钛涂钌电极板连接直流电源的正极，电源电压为23-46伏，使所述钛涂钌电极板带正电荷静电；将所述第二胶乳微球与带负电荷静电的橡胶板接触，所述橡胶板的静电电压为140-230伏，使所述第二胶乳微球带负电荷；使用所述带正电荷钛涂钌电极板接触所述带负电荷第二胶乳微球，使所述第二胶乳微球吸附到所述钛涂钌电极板上；配制质量浓度为1.2％-1.4％的低熔点琼脂糖凝胶，加热到34-39℃，倒在所述吸附第二胶乳微球的钛涂钌电极板上，所述低熔点琼脂糖凝胶的液面高度为所述第二胶乳微球直径的65％-75％，温度降低到32℃以下，凝固3-7小时，得到固定有第二胶乳微球的钛涂钌电极板；配制第二胶乳微球偶联所述壳多糖酶3样蛋白1抗体的反应液，反应液组成为mes·h2o2.6-5.3g/l、硼酸1.9-2.4g/l、磷酸氢二钠0.6-0.9g/l、所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体1170-1530mg/ml、edc·hci溶液0.11-0.23g/l、nhs溶液0.3-0.7g/l，将所述第二胶乳微球偶联所述壳多糖酶3样蛋白1抗体的反应液涂覆到经亲水处理的玻璃板上，在其表面形成抗体偶联反应液膜，所述液膜高度为胶乳微球直径的20％-30％，得到涂覆抗体偶联反应液的玻璃板；将所述固定有第二胶乳微球的钛涂钌电极板倒扣在所述涂覆抗体偶联反应液的玻璃板上，使所述第二胶乳微球裸露部分与所述偶联反应液接触，进行抗体偶联反应16-22h，反应温度25-27℃；将所述固定有第二胶乳微球的钛涂钌电极板与所述涂覆抗体偶联反应液的玻璃板分离，将含有吐温130-210ml/l和bsa1.6-1.9g/l的封闭液涂覆到所述固定有第二胶乳微球的钛涂钌电极板上，使所述第二胶乳微球裸露部分浸没于所述封闭液中，在28-30℃下进行5-8h封闭反应；在所述封闭液中加入proclin300，使其在该体系中浓度达到0.4-0.7ml/l，使用氢氧化钠溶液或者盐酸将ph调节到6.9-7.1，浸泡16-18h；将所述固定有第二胶乳微球的钛涂钌电极板浸没于温度38-40℃、ph6.8-7.0的磷酸盐缓冲液中，使凝固的所述低熔点琼脂糖凝胶液化，释放偶联完成的胶乳微球，将含有所述胶乳微球的物料趁热离心进行固液，使用所述ph6.8-7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3-4次，得到所述单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球；

24、配制第一试剂：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述抗干扰剂20-60mg/l、所述第一抗氧化剂12-16mmol/l、所述第一蛋白稳定剂600-1100mg/l、所述第一表面活性剂22-30mmol/l、所述无机盐5-7g/l、所述第一抗菌防腐剂30-60mg/l、所述缓冲液80-190mmol/l，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到6.6-6.9，得到所述第一试剂；

25、配制第二试剂：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球质量浓度0.18％-0.41％、所述单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球质量浓度1.08％-2.46％、所述第二抗氧化剂10-14mmol/l、所述第二蛋白稳定剂700-1000mg/l、所述第二表面活性剂20-26mmol/l、所述第二抗菌防腐剂40-80mg/l，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到7.0-7.2，得到所述第二试剂；

26、配制第三试剂：根据需要配制第三试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，所述第一空白胶乳微球质量浓度0.18％-0.41％、所述第二空白胶乳微球质量浓度1.08％-2.46％、所述第三抗氧化剂10-14mmol/l、所述第三蛋白稳定剂700-1000mg/l、所述第三表面活性剂20-26mmol/l、所述第三抗菌防腐剂40-80mg/l，溶解于相应体积的去离子水中，用盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调节到6.8-7.1，得到所述第三试剂。

27、优选地，所述第二胶乳微球包括无表面水的胶乳微球，首先将所述第二胶乳微球浸入超纯水中100-130min；然后过滤，用滤纸吸除多余水分；摊成0.6-0.9mm厚度薄层，在20-28℃、相对湿度50％-60％的无菌环境中放置7-11min，得到所述无表面水第二胶乳微球。

28、优选地，所述钛涂钌电极板表面涂覆绝缘层，所述绝缘层包括聚乙烯、聚丙烯、聚甲醛、尼龙、聚酰胺中的一种，所述绝缘层的厚度为20-50nm。

29、优选地，所述经亲水处理的玻璃板包括经等离子清洗处理的玻璃板。

30、优选地，制备所述单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球的环境相对湿度为86％-92％。

31、相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：①在第二试剂添加全表面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体的胶乳微球和单面负载壳多糖酶3样蛋白1抗体胶乳微球，使检测时产生的胶乳微球团聚体直径可控均一，提高待检体系浊度与待检样品中壳多糖酶3样蛋白1浓度的相关性，增加检测准确性；②设置带有同样组成但其胶乳微球不经修饰的第三试剂，作为严格参照吸光值，提高检测稳定性。