用于干燥与聚合物染料缀合的抗体的新的制剂的制作方法

背景技术：

1、多色流式细胞术是使用多种荧光标志物来鉴定和表征目的细胞亚群的快速发展的技术，其允许每秒对数万个细胞进行快速分析。流式细胞术使用抗体染料缀合物以对不同的生物样品(包括全血样品、骨髓和其他生物试样)进行染色。在正常人全血样品中，不同类型的细胞表达不同的标志物，例如t细胞中的cd4和b细胞中的cd20。当使用相互排斥的标志物(仅在一种特定细胞类型中表达的标志物)的反-抗标志物抗体荧光染料缀合物对其进行染色时，来自每种细胞的信号(荧光)在流式细胞仪中被捕获并数字转换以用于分析。

2、多色干燥试剂是包含多种不同抗体染料缀合物的干燥组合混合物，其可用于生物样品的流式细胞术分析。干燥试剂技术(dry reagent technology)用于提高生物分子的稳定性，其允许在室温下储存、简化样品制备、并使用户错误最小化。

3、多色干燥试剂混合物可包含与小分子(例如fitc)、串联(例如pc5.5)或大分子(例如apc)染料(例如cd4-fitc、cd8-pe、cd20-apc、pc5.5等)缀合的数种不同抗体，并可用于对多种生物试样中的细胞进行染色并在流式细胞仪中进行分析。

4、与现有的经典(单体)染料(fitc、pc5.5、apc等)缀合物相比，聚合物染料缀合物在结构和复杂性上不同。聚合物染料结构的刚性有助于降低旋转能量，导致更亮的发射。因此，聚合物染料缀合物特别可用于鉴定和分析几乎不表达受体的细胞。这些亮的聚合物染料可允许检测和分辨暗淡的群体。然而，聚合物染料(例如紫色聚合物染料)由于其固有的疏水性质，倾向于彼此相互作用并形成聚集体。

5、现有干燥技术使得能够在单个管中干燥不同的经典染料缀合物，而不改变功能(对抗原的亲和力)或物理特性(例如亮度和溢出)并在一段时间内稳定。“试剂缓冲剂”(reagent buffer，rb)是包含牺牲蛋白(sacrificial protein)、碳水化合物稳定剂、抗微生物剂和缓冲剂的现有技术制剂，其先前开发用于在不改变功能(对抗原的亲和力)或物理特性(例如亮度或荧光)的情况下在单个管中干燥不同的单体染料缀合物。“物理特性”是指荧光染料缀合物的亮度及其到其他通道中的溢出。例如，当使用现有干燥技术进行干燥并用于对生物试样进行染色时，表现出了使用cd4-pe染料缀合物的期望的流式细胞术结果。如图1a中所示，表现出了cd4 pe+单核细胞和cd4 pe+淋巴细胞的细胞群体的期望的功能、物理特性和分辨率。类似地，当使用现有技术进行干燥并用血液样品重构时，表现出了cd20apc染料缀合物的期望的流式细胞术结果。如图1b中所示，表现出了cd20 apc+细胞群体的期望的功能、物理特性和流式细胞术分辨率。

6、当使用试剂缓冲剂的现有干燥技术用于对在管中的两种聚合物染料抗体缀合物进行干燥时，它不能阻止聚合物染料缀合物之间的非特异性相互作用，从而导致聚集。一般而言，当使用现有干燥技术对两种或更多种聚合物染料抗体缀合物进行干燥时，它们倾向于彼此相互作用，导致不期望的结果。聚集导致其他通道中无法纠正的假阳性群体。该问题在图2a和图2b中示出。

7、图2a示出了cd20-605和cd4-786聚合物染料抗体缀合物在混合并使用现有干燥技术进行干燥时的不期望的流式细胞术结果。无法求解x轴和y轴上的群体被假定为溢出问题。然而，即使在溢出校正之后，群体也没有求解(图2b)。

8、图2b示出了cd20-605和cd4-786聚合物染料抗体缀合物在混合并使用具有溢出校正的现有干燥技术进行干燥时的不期望的流式细胞术结果。当使用现有干燥技术对两种聚合物染料抗体缀合物进行干燥时，无法将群体校正到其相应的荧光通道被认为是由于聚合物染料抗体缀合物的聚集。

9、存在对新的缓冲剂制剂的需要，所述缓冲制剂可以保持聚合物染料抗体缀合物的稳定并在干燥和重构过程时避免聚集，允许改善功能、物理特性和流式细胞术分辨率。

技术实现思路

1、提供了用于对基底上的多种染料缀合物进行干燥的新的缓冲剂组合物。染料缀合物可包含荧光染料缀合物。荧光染料缀合物可以是荧光染料和结合配偶体(例如抗体)的缀合物。荧光染料缀合物可以是与结合配偶体(例如抗体)缀合的荧光聚合物染料。荧光染料缀合物可以用于流式细胞术。缓冲剂组合物包含水溶性单体、蛋白质稳定剂、碳水化合物稳定剂、和两性离子表面活性剂。当缓冲剂组合物与包含两种或更多种荧光染料缀合物的多色荧光染料缀合物组混合、在基底上干燥、并用生物试样重构时，所述缓冲剂当与使用不含蛋白质稳定剂、水溶性单体或两性离子表面活性剂的缓冲剂相比时，提供了荧光染料缀合物聚集的降低。在一些情况下，缓冲剂组合物当与使用不含蛋白质稳定剂、单体或两性离子表面活性剂的缓冲剂相比时，还提供了染料与单核细胞非特异性结合的降低和/或染料与粒细胞非特异性结合的降低。

2、在一些实施方案中，本公开内容提供了组合物，其包含组中的多种荧光染料缀合物。在存在适当缓冲剂的情况下，组中的多种荧光染料缀合物可用于鉴定细胞亚群。在不存在适当缓冲剂的情况下，荧光染料缀合物可彼此相互作用，并导致染色伪影，这可影响数据解释。

3、提供了用于对基底上的多种染料缀合物进行干燥的缓冲剂组合物，其包含：水溶性单体；蛋白质稳定剂；碳水化合物稳定剂；和两性离子表面活性剂。多种染料结合配偶体缀合物中的至少一种、至少两种或至少三种可包含荧光聚合物染料部分。

4、水溶性单体可以是包含芳基部分或杂芳基部分的单体单元，其各自任选地具有与其连接的水溶性部分。水溶性部分可以是一个或更多个聚(乙二醇)部分。水溶性单体可适用于制备具有单体a亚基、单体b亚基或单体a和单体b亚基的组合的多种荧光聚合物染料中的至少一种。水溶性单体可以是基于二氢菲(dhp)的水溶性单体。水溶性单体可以是基于芴的水溶性单体。

5、水溶性单体可以是具有根据式(i)的化学结构的基于二氢菲(dhp)的单体：

6、

7、其中

8、每个g1、g2独立地选自卤素、烷基、peg、氢、炔烃、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、卤素取代的芳基、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯、乙酰氧基、叠氮化物、磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、任选经取代的四氢芘(thp)、任选经取代的芴、任选经取代的二氢菲(dhp)，芳基或杂芳基，其被一个或更多个侧链取代，所述侧链被选自以下的官能团封端：胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸盐/酯、马来酰亚胺、活化酯、n-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛和硫醇；

9、每个r2独立地选自水溶性部分、烯烃、炔烃、环烷基、卤代烷基、(杂)芳基氧基、(杂)芳基氨基、磺酰胺-peg、膦酰胺-peg、烷基铵盐、烷基氧基铵盐、寡聚醚铵盐、烷基磺酸盐、烷氧基磺酸盐、寡聚醚磺酸盐、磺酰胺基寡聚醚、磺酰胺、亚磺酰胺、膦酰胺酸酯、次膦酰胺、

10、

11、每个r3是水溶性部分；

12、每个r4独立地选自h、烷基、peg、水溶性部分、接头部分、发色团、羧酸胺、胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、n-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、或硫醇、或其被保护基团；

13、每个r5独立地选自h、羟基、c1-c12烷基、c2-c12烯烃、c2-c12炔烃、c3-c12环烷基、c1-c12卤代烷基、c1-c12烷氧基、c2-c18(杂)芳基氧基、c2-c18(杂)芳基氨基、c2-c12羧酸、c2-c12羧酸酯和c1-c12烷氧基；

14、每个q独立地是键、nr4或-ch2；

15、每个z独立地是ch2、o或nr4；

16、每个f独立地是0至50的整数；并且

17、每个n独立地是1至20的整数。

18、在一些实施方案中，每个g1、g2独立地选自卤素(f、cl、br、i)、c1-c6烷基和peg。

19、水溶性单体可以是具有根据式(ii)的化学结构的基于芴的单体：

20、

21、其中

22、每个g1、g2独立地选自卤素、烷基、peg、炔烃、氢、任选经取代的芳基、任选经取代的杂芳基、卤素取代的芳基、甲硅烷基、重氮盐、三氟甲磺酸盐/酯、乙酰氧基、叠氮化物、磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、任选经取代的四氢芘(thp)、任选经取代的芴、任选经取代的二氢菲(dhp)，芳基或杂芳基，其被一个或更多个侧链取代，所述侧链被选自以下的官能团封端：胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸盐/酯、马来酰亚胺、活化酯、n-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛和硫醇；

23、每个x是c或si；

24、每个r4独立地选自h、烷基、peg、水溶性部分、接头部分、发色团、羧酸胺、胺、氨基甲酸盐/酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、n-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔烃、醛、或硫醇、或其被保护基团；

25、每个r5独立地选自h、羟基、c1-c12烷基、c2-c12烯烃、c2-c12炔烃、c3-c12环烷基、c1-c12卤代烷基、c1-c12烷氧基、c2-c18(杂)芳基氧基、c2-c18(杂)芳基氨基、c2-c12羧酸、c2-c12羧酸酯和c1-c12烷氧基；

26、每个z独立地是ch2、o或nr4；

27、每个f独立地是0至50的整数；并且

28、每个n独立地是1至20的整数。

29、在一些实施方案中，每个g1、g2独立地选自卤素(f、cl、br、i)、c1-c6烷基和peg。

30、水溶性单体可以是具有根据式(iii)的化学结构的基于二氢菲(dhp)的单体：

31、

32、其中每个g1、g2独立地是卤素(f、cl、br、i)；每个z独立地选自o、ch2和nh；每个r1独立地是烷基(c1-c3)；每个r2独立地是h、烷基(c1-c6)；每个n独立地是1至6；并且每个m独立地是5至50。在一些实施方案中，g1、g2各自是br；每个z是o；每个r1是ch3；每个r2是h；每个n独立地是2至4；并且每个m独立地是5至20。在一些实施方案中，每个n是3；并且每个m是11或12。

33、蛋白质稳定剂可选自酪蛋白、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)和明胶中的一种或更多种。

34、碳水化合物稳定剂可以是二糖碳水化合物稳定剂。二糖碳水化合物稳定剂可以是海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖或蜜二糖、或其水合物。在一些具体实施方案中，二糖碳水化合物稳定剂可以是海藻糖或其水合物。碳水化合物稳定剂可以是海藻糖二水合物。

35、两性离子表面活性剂可包含根据式(xv)的结构：

36、

37、其中y＝co2-或so3-，w＝h或oh，z＝ch3或nhc(o)r，其中r＝c1-15烷基；独立地，每个p＝0或1；并且q＝0至21；任选地，其中w＝h，z＝ch3，并且q＝11至15。

38、两性离子表面活性剂可选自3-(n,n-二甲基肉豆蔻基氨基丙烷磺酸酯(dmma)、3-[n,n-二甲基(3-棕榈酰氨基丙基)氨基]-丙烷磺酸酯(dmpa)、n-(烷基c10-c16)-n,n-二甲基甘氨酸甜菜碱、和n,n-二甲基-n-十二烷基甘氨酸甜菜碱。

39、任选地，缓冲剂组合物可包含一种或更多种、两种或更多种或者三种或更多种另外的添加剂，所述另外的添加剂选自防腐剂、抗氧化剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和着色剂。

40、缓冲剂组合物的ph可以在ph 6.5至7.5的范围内。在一些情况下，水性缓冲剂组合物的ph可以在ph 7.0至7.4的范围内。

41、缓冲剂组合物每次测试可包含：200至800μg的单体；2000至3000μg的碳水化合物稳定剂；8.4至72μg的蛋白质稳定剂；和2至15μg的两性离子表面活性剂。

42、缓冲剂组合物每次测试可包含：300至600μg的单体；2200至2800μg的碳水化合物稳定剂；15至20μg的蛋白质稳定剂；和8至12μg的两性离子表面活性剂。

43、在一些实施方案中，缓冲剂组合物可包含多种荧光染料缀合物。在一些实施方案中，缓冲剂组合物可包含多种荧光聚合物染料缀合物。荧光聚合物染料缀合物各自根据本公开内容可包含根据式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)、式(x)、式(xi)、式(xii)、式(xiii)和/或式(xiv)的结构。

44、在另一些实施方案中，水性缓冲剂组合物不包含多种荧光染料缀合物。在另一些实施方案中，水性缓冲剂组合物不包含任何荧光染料缀合物。

45、提供了制备单一反应物膜的新的方法，该方法包括将液相中的多种反应物一起分配到基底上，所述液相包含根据本公开内容的缓冲剂组合物，多种反应物包含第一反应物和第二反应物，第一反应物包含与第一染料缀合的第一结合配偶体，其中第一染料包含荧光聚合物染料；第二反应物包含与第二染料缀合的第二结合配偶体；以及将液相水性缓冲剂中的第一反应物和第二反应物一起干燥以在基底上形成第一单一反应物膜。第二染料可以是荧光聚合物染料。单一反应物膜可以是包含多种反应物的均匀膜。多种反应物可包含两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、或者12种或更多种反应物，或者2至20种、3至18种或4至12种各自包含不同的结合配偶体染料缀合物的不同反应物。染料可以是荧光染料。荧光染料可以是荧光聚合物染料。例如，每种反应物可以是独特的荧光染料缀合物。多种反应物可包含两种或更多种独特的荧光聚合物染料缀合物。基底可以是管、孔、膜或珠。基底可包含反应容器的内表面。

46、本公开内容提供了单一反应物膜，其为包含通过本公开内容的新的方法制备的多种反应物的均匀膜。当与通过将包含第一反应物和第二反应物的第二单一反应物膜暴露于液体生物样品的第二等分试样、处理并通过流式细胞术分析而获得的第二流式细胞术图相比时，在单一反应物膜暴露于液体生物样品的第一等分试样、处理并通过流式细胞术分析之后，单一反应物膜将提供第一流式细胞术图，其表现出以下的一个或更多个：单核细胞非特异性结合的降低；粒细胞非特异性结合的降低；荧光染料缀合物非特异性相互作用的降低；荧光染料缀合物聚集的降低，其中第二单一反应物膜是用不含水溶性单体并且不含两性离子表面活性剂的现有技术的液相制备的。荧光染料缀合物可以是荧光聚合物染料缀合物。

47、根据本公开内容的缓冲剂组合物使得能够在单个管中干燥不同的荧光染料缀合物，以提供均匀的膜，而不改变功能(即对分析物的亲和力)和物理特性(例如亮度或荧光)，同时避免聚集和随后的假阳性群体进入到其他通道中。