一种基于硅球金壳的六联检SERS免疫层析法

本发明涉及sers免疫层析。具体地说是一种基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法。

背景技术：

1、随着人类社会的发展，不断涌现的重大新发突发传染病呈现从简单到复杂、从偶发到频发、防范难度逐渐加大的趋势，已成为人类发展面临的新型安全威胁。新突发传染病具有传播速度快、传播范围广、致病性强等特点，对人类的健康造成严重危害，在全球范围内造成重大经济损失。现有的检测技术主要有聚合酶链反应、质谱分析技术、dna测序技术、酶联免疫吸附法、电镜技术、免疫层析等。尽管这些技术具有高灵敏、高特异性等优势，但存在操作步骤繁琐、分析时间长、成本高、灵敏度低、需要先进的仪器和工作人员等缺点。亟需开发一种高灵敏度、高准确性、简便、快速的检测技术，能够及时诊断出新突发传染病病原体的种类，从而及早地采取预防和精准治疗措施，缩小疾病的传播范围以防止大规模暴发。

2、免疫层析技术具有操作简单、携带方便、检测快速的优势，在现场快速检测领域有巨大的应用潜力。传统的免疫层析技术是以胶体金纳米颗粒作为免疫标签，制备简单、成本低，但重复性差、灵敏度低、只能对检测结果定性或半定量，限制了其广泛应用。为了提高免疫层析的检测灵敏度和定量检测能力，研究者利用荧光纳米标签来取代胶体金纳米颗粒，如量子点、荧光金属颗粒、上转换发光荧光微球等。然而，基于荧光标签的检测结果易受光漂白和背景荧光的干扰。表面增强拉曼散射(sers)由于其灵敏度高、抗光漂白、光谱带宽窄等优势，目前已广泛应用于小分子、核酸、蛋白、病毒、细菌等生化分析领域。将sers标签取代传统的胶体金纳米颗粒应用于免疫层析，在很大程度上提高了免疫层析检测的灵敏度和特异性，并且实现了对痕量物质的快速、高灵敏定量检测。此外，商业化的胶体金免疫层析试剂盒通常只能检测一种病原体，检测通道少，检测目标单一，不利于对新突发传染病病原体的快速精准筛查。因此，需要开发一种可以对多种新突发传染病病原体进行快速准确高灵敏的定量检测技术。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，以解决现有检测技术对多种新突发传染病病原体的检测存在检测通道少、检测目标单一以及检测灵敏度和特异性不高等问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，包括如下步骤：

4、步骤a：制备双层dtnb修饰的sio2@au复合纳米材料sio2/dtnb@au/dtnb；

5、步骤b：分别在sio2@au复合纳米材料表面偶联六种病原体抗体，得到病原体的sers标签；

6、步骤c：分别利用病原体的sers标签制备免疫层析试纸条，得到免疫层析试纸条；

7、步骤d：将不同病原体的免疫层析试纸条集装在多通道免疫层析柱内，得到六联检sers免疫层析系统；

8、步骤e：利用六联检sers免疫层析系统进行相应病原体的同时检测。

9、本发明开发的基于双层dtnb修饰的sio2@au的六联检sers免疫层析法，其核心包括双层dtnb修饰的sio2@au复合纳米材料的制备、基于sio2@au复合纳米材料的sers标签的制备、集成化多通道免疫层析柱的制备和sio2@au的多通道sers免疫层析系统的建立以及利用高通量sers-侧流免疫层析检测仪采集各试纸条上t线的sers信号。六联检sers免疫层析检测系统中的层析柱可在一次检测中筛查分析六种新突发传染病病原体，优异的特异性和多通道的分析性能大大提高了检测范围和效率。

10、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤a中，双层dtnb修饰的sio2@au复合纳米材料的制备方法为：

11、步骤(a-1)、sio2纳米颗粒的制备：将无水乙醇、氨水和水搅拌混合均匀，加入正硅酸乙酯，搅拌进行充分反应；反应结束后将分离得到的固体颗粒用无水乙醇洗涤后置于真空烘箱中真空干燥，得到sio2纳米颗粒干粉；

12、步骤(a-2)、13nm胶体金的制备：向水中加入氯金酸溶液，加热至沸腾后加入柠檬酸钠，继续保持沸腾，然后停止加热并搅拌至室温，即得到13nm胶体金；

13、步骤(a-3)、sio2-au seeds的制备：将sio2纳米颗粒干粉加入水中进行第一次超声，然后加入聚乙烯亚胺溶液进行第二次超声；第二次超声结束后固液分离得到的固体物用水洗涤后加水重悬；接着加入步骤(a-2)中制备的13nm胶体金进行第三次超声，第三次超声结束后进行固液分离，并将分离物水洗后用无水乙醇重悬，即得到sio2-au seeds悬浮液；

14、步骤(a-4)、sio2-au seeds/dtnb的制备：将5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加入到步骤(a-3)中制备的sio2-au seeds悬浮液中进行超声，超声结束即得到sio2-auseeds/dtnb悬浮液；

15、步骤(a-5)、sio2/dtnb@au的制备：将步骤(a-4)中制备的sio2-au seeds/dtnb悬浮液加入水中混合均匀，再加入聚乙烯吡咯烷酮和盐酸羟胺进行第一次超声，然后加入氯金酸溶液进行第二次超声；第二次超声结束后离心，将离心得到的固体水洗后用乙醇重悬，即为sio2/dtnb@au悬浮液；

16、步骤(a-6)、sio2/dtnb@au/dtnb的制备：将5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加入到步骤(a-5)中制备的sio2/dtnb@au悬浮液中进行超声，超声结束即得到双层dtnb修饰的sio2@au复合纳米材料sio2/dtnb@au/dtnb悬浮液。

17、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤(a-1)中，无水乙醇、氨水和水的体积之比为100:4:6，氨水的质量浓度为28wt％；搅拌混合的时间为10min；正硅酸乙酯和氨水的体积之比为1:1；加入正硅酸乙酯后的反应时间为2～3h；真空干燥温度为60℃，真空干燥时间为6h；在该反应条件下制备的sio2纳米颗粒粒径均匀，基本都在150-200nm范围内，不仅具有较好的分散性，而且有利于后续金壳的顺利生成；

18、步骤(a-2)中，水和氯金酸溶液的体积之比为100:4，氯金酸溶液的质量浓度为1wt％，柠檬酸钠与水的质量之比为(0.11～0.12):100；继续保持沸腾的时间为15min；

19、步骤(a-3)中，每10mg sio2纳米颗粒干粉加入到40ml水中，第一次超声的时间为10min；聚乙烯亚胺溶液的加入量与水的体积之比为1:10，聚乙烯亚胺溶液的质量浓度为10mg/ml，第二次超声时间为30min；固液分离的条件为6000rpm离心6min，第二次超声结束后固液分离固体物重悬时所用水的体积与聚乙烯亚胺溶液的体积之比为2:1；13nm胶体金的用量与重悬时所用水的体积之比为10:1，第三次超声时间为30min；第三次超声结束后，重悬时所用无水乙醇的体积与所用13nm胶体金的体积之比为1:4；

20、步骤(a-4)中，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液的浓度为10mmol/l，每5μl的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加入到1ml的sio2-au seeds悬浮液中超声1h；

21、步骤(a-5)中，sio2-au seeds/dtnb悬浮液与水的体积之比为1:30；聚乙烯吡咯烷酮和盐酸羟胺的质量之比为8:1，且盐酸羟胺与水的质量之比为1:2000；第一次超声的时间为10min，氯金酸溶液与sio2-au seeds/dtnb悬浮液的体积之比为0.15:1，氯金酸溶液的质量浓度为1wt％，第二次超声的时间为10min；固液分离的条件为2600rpm离心6min；重悬时所用无水乙醇的体积与所用sio2-au seeds/dtnb悬浮液的体积之比为2.5:1；

22、步骤(a-6)中，5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液的浓度为10mmol/l，每8μl的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液加入到1ml的sio2-au seeds悬浮液中超声1h。

23、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤b中，病原体为甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒、埃博拉病毒、登革热病毒和寨卡病毒六种。

24、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤b中病原体的sers标签的制备方法为：

25、步骤(b-1)、将sio2/dtnb@au/dtnb悬浮液离心后弃去上清液，并加入mest缓冲液重悬，再加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺进行超声，超声结束后离心分离并将离心得到的沉淀物用pbst缓冲液重悬，得到pbst重悬液；

26、步骤(b-2)、向pbst重悬液中加入相应的病原体抗体进行第一次振荡反应，反应结束后加入牛血清白蛋白进行第二次振荡反应；反应结束后进行离心分离，并将分离物用pbst缓冲液洗涤后再加入pbst缓冲液重悬，即制备得到相应病原体的sers标签。

27、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤(b-1)中，mest缓冲液的ph为6，浓度为10mm【1微升吐温-20加入到10毫升、浓度为10mm、ph＝6的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)溶液中配制成浓度为10mm、ph＝6的mest】；重悬时所用mest缓冲液的体积与所用sio2/dtnb@au/dtnb悬浮液的体积相等；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺与mest缓冲液的体积之比为5:10:500；超声时间为15min，离心分离条件为2600rpm离心6min；重悬时pbst缓冲液的用量与所用sio2/dtnb@au/dtnb悬浮液的体积之比为2:5；本发明所用的pbst缓冲液的配制方法为：将5μl吐温-20加入到10ml浓度为10mm的pbs溶液中混合均匀即可；

28、步骤(b-2)中，每200μl的pbst重悬液中加入10μg的病原体抗体；第一次振荡反应时间为2h；牛血清白蛋白的质量浓度为10wt％；牛血清白蛋白与pbst重悬液的体积之比为1:2；第二次振荡反应时间为1h；离心分离条件为2600rpm离心6min；重悬分离物时所用pbst缓冲液的体积与所用pbst重悬液的体积相等。

29、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤c中，免疫层析试纸条的制备方法为：

30、步骤(c-1)、将病原体的sers标签用金标试剂稀释后混匀，均匀涂布在金垫上并干燥，干燥结束后即得到病原体结合垫；

31、步骤(c-2)、用划膜仪将病原体的检测抗体喷涂在硝酸纤维素膜的t线上，山羊抗鼠igg抗体喷涂在硝酸纤维素膜的c线上，干燥后，得到病原体nc膜；

32、步骤(c-3)、在聚氯乙烯底板上依次组装吸水垫、病原体nc膜、病原体结合垫和吸水垫，组装完成后进行裁剪，即制备得到相应病原体的免疫层析试纸条。

33、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤(c-1)中，病原体的sers标签与金标试剂的体积之比为1:2；金标试剂的配制方法：向100ml水中加入0.1g peg-20000、3g海藻糖、3g蔗糖、1ml吐温-20和0.5g牛血清白蛋白混合均匀；干燥条件为37℃干燥4h；步骤(c-2)中，干燥条件为37℃干燥2h。

34、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，步骤e中病原体同时检测的方法为：将待测样本加入病毒裂解液中混合均匀，然后滴加在六联检sers免疫层析系统的多通道免疫层析柱的加样孔内进行免疫反应；待免疫反应结束后，利用高通量sers-侧流免疫层析检测仪采集集成化多通道免疫层析柱内各试纸条t线上的sers信号，通过分析拉曼报告分子拉曼特征位移处的sers信号强度对样本中的病毒进行定量分析。

35、上述基于硅球金壳的六联检sers免疫层析法，免疫反应的时间为20min；病毒裂解液的配制方法为：向10ml ph为8.2且浓度为0.1mol/l的tris中加入0.2ml的triton 100、100mg的pvp(k30)和29.22mg的edta混合均匀。

36、本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：

37、1、本发明基于硅球金壳的六联检sers免疫层析方法，在硅球金壳复合纳米材料上修饰了双层拉曼报告分子，提供了较强的sers信号，同时提供了丰富的羧基从而可以结合更多的特异性抗体，增强了硅球金壳复合纳米材料捕获病原体抗原的能力，提高了检测灵敏度。

38、2、本发明基于硅球金壳的六联检sers免疫层析方法，既可通过肉眼进行定性检测，亦可采集t线上的sers信号实现定量检测。并且该方法中集成化多通道免疫层析柱的制备方法简单、成本低，可实现批量生产。

39、3、本发明提出的六联检sers免疫层析技术检测灵敏度高，检测范围广，可一次性检测六种新突发传染病病原体，在20分钟内可快速筛查患者感染病原体的类型，具有广阔的实际应用前景。