一种简便的野兔热杆菌的检测方法与流程

本发明涉及一种简便的野兔热杆菌的检测方法，属于生物检测方法。

背景技术：

1、野兔热(rabbittularemia)又叫土拉热、土拉杆菌病，是土拉热弗朗西斯菌引起的人兽共患的一种急性传染病。主要症状是体温升高，淋巴结肿大，脾脏及其他内脏器官坏死并形成干酪样病灶。本病主要见于野生啮齿动物，再由它传染给家畜和人，因此属于自然疫源性疾病。野兔热多数发生在北半球国家，流行于北纬30°～71°地区。我国于1957年在内蒙古通辽地区首次发现野兔热病例，并从病人和死亡黄鼠体内分离到本病病原体；1959年，我国第1例人野兔热病例在黑龙江省被报道；1986年，山东省胶南县某野兔肉加工厂暴发野兔热疫情，10天之内发病31人；1992年，从西藏地区银盾革蜱中发现10多株土拉热弗朗西斯菌。1991—1993年，刘增加等在甘肃省西部祁连山和南部迭部林区发现人群中存在野兔热的隐性感染，血清阳性率分别为9.8％、10.3％。之后我国其他地区陆续发现存在土拉热弗朗西斯菌感染和其自然疫源地，鉴于野兔热危害较大，我国将其列为二类动物疫病。

2、野兔热杆菌的高灵敏快速检测难题和检测样本信息的长时间保存问题。首先，野兔热杆菌具有较强的致病性，具有应用于生物武器的巨大潜力。其次，高灵敏快速检测是对传染性疾病有效防范的关键技术，目前能够进行个位数量级的检测方法主要是传统的培养法以及核酸检测法。传统的培养法需要较长的时间，而核酸检测方法则需要昂贵的设备以及专业人员操作，这都无法满足高灵敏、快速、便捷的检测需求。最后，现有基于生物传感器检测方法的野兔热杆菌检测技术，存在检测信号不稳定，重复性差等问题，当样本检测完毕后就不能再次检测。因此，为了进一步提高野兔热杆菌检测的可靠性和可复测性，有必要解决样本信号的长时间保存问题。

3、随着交叉学科的发展，生物芯片技术应运而生，其具有的小型化、低功耗、高集成等优势使得生物芯片在细菌、病毒等生物目标检测方面具有巨大的应用潜力，而基于巨磁电阻效应的磁生物芯片是其中的一员，巨磁电阻效应是金属材料在外磁场的作用下使其电阻值发生变化的效应，基于该效应制备的电子器件如磁存储、磁传感器等具有广泛的应用前景，gmr生物芯片主要利用基于巨磁电阻效应的gmr磁传感器与免疫磁珠技术结合而成，相对于其他的生物芯片技术(如荧光、电化学等)，基于磁电子的生物芯片具有背景噪声低、均一性好、易集成等优势，使得gmr生物芯片非常适合于野兔热杆菌的检测，而且基于磁性纳米粒子的生物样本稳定性好，保存时间长，可以将野兔热杆菌的检测样本多次重复检测。

4、目前，基于gmr生物传感器的细菌检测技术已经达到100cfu/ml量级，但是检测灵敏度与其他生物传感器相比，如荧光传感器、电化学传感器(10cfu/ml量级)等还存在较大差距，限制了gmr磁生物芯片在野兔热杆菌的应用潜力，为了解决基于磁传感器芯片的野兔热杆菌检测样本信息长期保存问题，同时兼具较高的检测性能，有必要开发新型的gmr生物芯片技术。现有的gmr生物芯片技术主要利用gmr传感器检测磁性标签的微弱杂散磁场获得生物检测功能，但该方法受限于所使用的磁性标签产生的杂散磁场较弱，无法实现更高灵敏度的检测，所以需要开发新的检测方法，以获得更高的检测能力。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：提供一种简便的野兔热杆菌的检测方法，以解决上述现有技术中存在的问题。

2、本发明采取的技术方案为：一种简便的野兔热杆菌的检测方法，包括以下步骤：

3、s1，gmr生物芯片的准备，gmr生物芯片包括微流控反应腔，gmr生物芯片表面设置有sio2生化反应膜；

4、s2，野兔热杆菌在gmr生物芯片上的捕获，包括以下步骤：

5、s2.1，磁性靶向标签的制备；

6、s2.2，野兔热杆菌的磁性修饰；

7、s2.3，gmr生物芯片表面功能化修饰，在gmr生物芯片表面sio2生化反应膜上，利用化学修饰的方法制备生物自组装膜，将二抗修饰在自组装膜表面，使得gmr生物芯片表面具有捕获野兔热杆菌的能力；

8、s2.4，野兔热杆菌捕获，将基于抗原抗体反应的修饰有磁性靶向标签的野兔热杆菌经过微流控反应腔注入到gmr生物芯片表面，通过抗原抗体反应，使得磁性标签标记的野兔热杆菌捕获在gmr生物芯片表面，获得了利用抗原抗体反应捕获野兔热杆菌后的gmr生物芯片；

9、s3，gmr生物芯片的测试，野兔热杆菌信息的读出。

10、优选的，所述步骤s1中，gmr磁生物芯片包括板状的衬底，所述衬底的上端面设置有gmr线条，所述衬底的上端面位于所述gmr线条两侧的位置分别设置有一个磁力线聚集器，两个所述磁力线聚集器之间磁化方向与所述gmr线条垂直；所述gmr线条尾部各自覆盖有一个电极，两个所述电极分别电性连接有电极引脚；所述衬底的上端面、所述磁力线聚集器的上端面均设置有氮化硅保护膜，所述sio2生化反应膜设置在所述gmr线条的上端面的所述氮化硅保护膜上；所述电极包括电极底层和电极上层；所述微流控反应腔设置在所述衬底的上端面位于所述gmr线条周围的部分，所述gmr线条以及所述电极均位于微流控反应腔内部。

11、优选的，gmr线条为曲折型结构，线条的线宽为5μm，长度为500μm，间隙为15μm。

12、优选的，磁力线聚集器为矩形的feni薄膜，厚度为2μm。

13、优选的，微流控反应腔是封闭的，覆盖了gmr线条区域。

14、优选的，电极底层为cr/cu电极层，厚度为10nm/150nm。

15、优选的，电极上层为au电极层，厚度为150nm。

16、优选的，氮化硅保护膜的厚度为20nm。

17、优选的，sio2生化反应膜的厚度为10nm。

18、优选的，gmr生物芯片的制作步骤如下：

19、步骤一：gmr线条图形化，在衬底表面进行gmr线条的图形化；

20、步骤二：磁力线聚集器制作，在衬底表面进行磁力线聚集器图形化；

21、步骤三：电极底层制作，在衬底进行电极图形化，然后镀cr/cu电极层；

22、步骤四：氮化硅保护膜制作，在衬底整个表面上加工氮化硅保护膜，然后进行电极图形化，刻蚀电极表面的氮化硅层，直到第一层电极露出；

23、步骤五：sio2生化反应膜制备，在gmr线条区域图形化生化反应区域利用溅射工艺制备sio2生化反应膜；

24、步骤六：电极上层制作，电极上层制作，在gmr线条区域上进行生化反应膜的图形化，在衬底进行电极图形化，镀au电极层作为电极上层；

25、步骤七：微流控反应腔制作，在衬底表面的gmr检测区域制作微流控反应腔，用于检测反应。

26、优选的，gmr线条利用离子束刻蚀工艺制作。

27、优选的，磁力线聚集器通过溅射工艺制备，并且利用liftoff工艺实现图形化。

28、优选的，电极底层通过溅射工艺制作，电极上层通过热蒸发工艺制作。

29、优选的，氮化硅保护膜，通过pecvd工艺制作。

30、优选的，sio2生化反应膜，通过溅射工艺制备。

31、优选的，微流控反应腔为pdms工艺制备。

32、优选的，所述步骤s3中包括以下步骤：将未发生生化反应的gmr生物芯片固定在第一螺线管和第二螺线管中间，接通gmr生物芯片和检测电路，给gmr生物芯片供给一定的工作电流，给第一螺线管和第二螺线管施加电流，使gmr区域产生磁场，记录未发生生化反应的gmr生物芯片输出的电压值；同理，记录已发生生化反应后的gmr生物芯片输出的电压值；通过两个电压值的差值来判断生物目标的信息。

33、本发明的有益效果：

34、1.与现有技术相比，本发明基于“磁场分流检测法”。该种方法主要是通过利用磁力线聚集器在gmr检测区域形成一个静磁场，然后利用磁性标签对该磁场进行分流，改变检测区域的磁场，带来gmr器件的信号变化，从而实现对磁性标签的检测。磁性标签数量越多，分流的磁场也就越多，对gmr器件的信号的影响也就越强，实现对生物目标的定量检测。相对于传统的gmr生物芯片，本发明的gmr生物芯片具有明显提升信号强度的能力，并且在检测极限上，本发明最低可以检测到45cfu/ml(gmr的输出值mr为105ppm)，传统的gmr生物芯片只能检测到188cfu/ml(gmr的输出值mr为90ppm)，由此可见本发明的gmr生物芯片在检测灵敏度上较传统的检测方法提升将近4倍，在相同浓度(如500cfu/ml浓度)的检测输出信号强度上也提升将近5倍，而且利用磁力线聚集器可以降低gmr工作所需的外界磁场，降低了检测系统的功耗，这将推进gmr生物芯片在高灵敏生物检测领域的具体应用。

35、2.与现有技术相比，本发明，不仅进一步提高gmr生物芯片的检测灵敏度，而且其制备工艺过程易与现有的微流控技术兼容，可以实现整个生物芯片的检测过程封闭实施，提高了gmr磁生物芯片的系统性、安全性和便捷性。该芯片技术具有小型化、低功耗、器件均一性好等优势，可在生物安全、食品质检、疾病诊断等领域发挥巨大作用。