用于监测患者中的癌症的方法与流程

本发明涉及一种用于检测和/或监测患者中的癌症的免疫测定方法。

背景技术：

1、自身免疫性疾病(诸如类风湿性关节炎(ra))和癌症是全球两大健康问题，对患者来说临床环境具有挑战性。两种疾病是由免疫系统的失衡和失调驱动的。然而，虽然ra与过度免疫激活相关联，但癌症患者典型地具有抑制的免疫应答。在自身免疫性疾病中，自身反应性淋巴细胞和针对自身表位和自身抗原的自身抗体的产生的启动导致异常和不希望的免疫应答(在其他功能性组织或器官中)，并伴有相关的组织破坏，并且最终导致器官功能丧失(1)(2)。在癌症中，免疫系统受到抑制，并且通常应消除肿瘤的淋巴细胞表现有耗尽和无活性表型(3)(4)。这可能使原发性肿瘤和癌细胞不受控制地生长、转移到其他器官，并且在许多情况下，死亡是最终结果。

2、自身免疫性疾病和癌症的主要重叠和基本过程之一是由纤维化、慢性炎症状态和持续的伤口愈合过程引起的结缔组织重塑(5)(6)。增强且慢性的结缔组织周转表现为细胞外基质蛋白(其中胶原是主要组分)的合成和降解增加(5)(6)。为大多数自身免疫性疾病患者的特征的此现象可能导致恶性循环，其中发展针对胶原产物的自身反应性和自身抗体，从而维持不希望的炎症和组织破坏(5)。已显示ra患者的针对i型和ii型胶原的循环抗体的水平升高(7)(8)(9)，但针对瓜氨酸化形式的i型和ii型胶原的循环抗体的水平也升高(10)(11)(12)。尽管肿瘤微环境中的结缔组织周转增加，然而，很少研究已研究免疫细胞(诸如b细胞)如何响应于癌组织中胶原的积累。

3、svobodova等人(13)描述了使用间接elisa测定检测青少年型慢性关节炎(jca)患者和ra患者的血清中针对天然人i、ii和iii型的抗体。该研究报告，与年龄匹配的健康个体相比，针对所有三种胶原类型的抗体滴度明显更高。此外，ra患者的平均滴度高于jca患者。

4、trentham等人(14)描述了来自类风湿性关节炎患者的单核细胞在体外响应于人ii型和iii型胶原表现出细胞敏感性，导致细胞增殖，但没有报吿针对这些胶原的变性α链有细胞应答。

5、elkayam等人(15)描述了51名类风湿关节炎患者和健康对照对人胶原ii和iii的t细胞免疫应答。据发现，57％的ra患者和27％的健康对照对胶原iii产生增殖应答。较低比例-38％的ra患者和17％的健康对照者对胶原ii有增殖应答。

6、fehr等人(16)表明天然和变性的i、ii和iii型胶原是能够诱导ra患者中t细胞激活的自身抗原，ra患者的滑膜组织在某种程度上合成针对天然和变性的i、ii和iii型胶原的抗体，并且所有这些抗体似乎参与ra关节中的免疫复合物形成并激活补体系统。

7、kresina等人(17)描述了使用igg诱导的免疫滑膜炎动物模型研究细胞介导的针对天然和变性i、ii和iii型胶原的免疫应答的实验。将来自滑膜炎动物的脾细胞培养物体外暴露于天然胶原i、ii和iii抗原显示出t细胞来源的细胞反应性，其发生率为：i型，43％；ii型，43％；iii型，57％。在同一动物的培养物中观察到针对变性胶原的免疫应答的发生率更高：i型，50％；ii型，50％；iii型，67％。

8、tishler等人(18)描述了通过放射免疫测定在来自42名类风湿性关节炎患者的血清样品中检测针对天然人i型和iii型胶原的抗体。作者报告说，38％的研究患者的抗体滴度显著升高。此外，胶原抗体的存在与hla-dr4之间存在显著关联。

9、stuart等人(19)使用放射免疫测定描述了来自类风湿性关节炎患者的血清和滑液中存在针对天然和变性i、ii、iii、iv和v型胶原的抗体。来自30名ra患者的血清对所有胶原的平均结合水平显著高于来自20名正常受试者的那些。胶原的变性导致ra血清的结合增加。与天然iii型胶原相比，与变性iii型胶原的结合高超过2倍。

10、menzel等人(20)描述了在来自具有变性iii型胶原的ra患者的滑液中发现的抗i型抗体的强烈交叉反应性。该研究使用放射免疫测定作为检测方法。

11、beard等人(21)描述了使用血凝方法在类风湿性关节炎和慢性下背痛患者中针对天然和变性胶原i、ii和iii的抗体的微量或阴性存在。作者报告，在30％-40％的测试血清中针对变性胶原i和ii的反应较弱。在来自所有患者的血清中对天然和变性胶原iii的反应基本呈阴性

12、ingrosso等人(22)的一项研究已显示，与健康对照相比，前列腺癌患者中针对i型和iii型胶原的自身抗体升高。

13、fernandez-madrid等人(23)的一项研究已显示，与健康对照相比，肺癌患者中针对i、ii、iii和v型胶原的自身抗体的血清水平显著更高。

技术实现思路

1、本发明人开发了一种用于定量样品中抗变性iii型胶原抗体(抗dcol3)的量的新颖免疫测定，并且已显示来自各种类型癌症患者的样品中抗dcol3的水平低于健康对照。本发明人还显示，来自卵巢癌或胃癌患者的样品中抗变性ii型胶原抗体(抗dcol2)的水平低于健康对照。

2、因此，在第一方面，本发明提供了一种用于检测和/或监测患者中的癌症的免疫测定方法，所述方法包括：

3、i)使来自患者的样品与变性iii型胶原接触；

4、ii)检测并确定所述变性iii型胶原与所述样品中特异性识别并结合变性iii型胶原的抗体(此类抗体在本文中称为“抗变性iii型胶原抗体”或“抗dcol3”)之间的结合量；以及

5、iii)使在步骤(ii)中确定的所述变性iii型胶原与所述抗体之间的结合量与跟正常健康受试者相关联的值、和/或与跟已知疾病严重程度相关联的值、和/或与在先前时间点从所述患者获得的值、和/或与预定的截断值产生关联。

6、优选地，所述免疫测定是固相免疫测定，其中在步骤(i)中，变性iii型胶原与固体载体结合。优选地在步骤(ii)中，通过以下方式检测并确定所述变性iii型胶原与所述样品中特异性识别并结合变性iii型胶原的抗体之间的结合量：

7、a)添加检测抗体，其中所述检测抗体与来自所述样品的抗体特异性反应；以及

8、b)检测并确定所述检测抗体与来自所述样品的与所述固体载体上所述变性iii型胶原结合的抗体之间的所述结合量。

9、在优选的实施方式中，所述检测抗体与人免疫球蛋白g(igg)抗体特异性反应。例如，所述检测抗体可以特异性识别并结合人igg恒定区域。所述检测抗体可以例如是单克隆抗体。所述检测抗体可以例如是放射性标记的，可以连接至荧光团或者可以是酶连接抗体。

10、在优选的实施方式中，所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈部癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。

11、所述来自患者的样品优选地是生物流体。所述生物流体可以是但不限于血清、血浆、尿液或者来自细胞或组织培养物的上清液。优选地，所述生物流体是血清或血浆。优选地，所述患者是人(且因此所述患者样品是人患者样品)。

12、所述免疫测定可以是但不限于放射免疫测定、荧光免疫测定或酶联免疫吸附测定。

13、在第二方面，本发明提供了一种用于检测和/或监测患者中的卵巢癌或胃癌的免疫测定方法，所述方法包括：

14、i)使来自患者的样品与变性ii型胶原接触；

15、ii)检测并确定所述变性ii型胶原与所述样品中特异性识别并结合变性ii型胶原的抗体(此类抗体在本文中称为“抗变性ii型胶原抗体”或“抗dcol2”)之间的结合量；以及

16、ii)使在步骤(ii)中确定的所述变性ii型胶原与所述抗体之间的所述结合量与跟正常健康受试者相关联的值、和/或与跟已知疾病严重程度相关联的值、和/或与在先前时间点从所述患者获得的值、和/或与预定的截断值产生关联。

17、优选地，所述免疫测定是固相免疫测定，其中在步骤(i)中，变性ii型胶原与固体载体结合。优选地在步骤(ii)中，通过以下方式检测并确定所述变性ii型胶原与所述样品中特异性识别并结合变性ii型胶原的抗体之间的结合量：

18、a)添加检测抗体，其中所述检测抗体与来自所述样品的抗体特异性反应；以及

19、b)检测并确定所述检测抗体与来自所述样品的结合到所述固体载体上的所述变性ii型胶原的抗体之间的所述结合量。

20、在优选的实施方式中，所述检测抗体与人免疫球蛋白g(igg)抗体特异性反应。例如，所述检测抗体可以特异性识别并结合人igg恒定区域。所述检测抗体可以例如是单克隆抗体。所述检测抗体可以例如是放射性标记的，可以连接至荧光团或者可以是酶连接抗体。

21、所述来自患者的样品优选地是生物流体。所述生物流体可以是但不限于血清、血浆、尿液或者来自细胞或组织培养物的上清液。优选地，所述生物流体是血清或血浆。优选地，所述患者是人(且因此所述患者样品是人患者样品)。

22、所述免疫测定可以是但不限于放射免疫测定、荧光免疫测定或酶联免疫吸附测定。

23、如本文所用，关于变性ii或iii型胶原与样品中抗体之间的结合量的术语“结合量”是指对所述变性胶原与患者样品中所述抗体之间的结合的定量。同样，关于检测抗体与结合到与固体载体结合的变性ii或iii型胶原的来自样品的抗体之间的结合量，它是指对所述检测抗体与来自患者样品的所述抗体之间的结合的定量(因此，这反过来又与变性胶原与患者样品中抗体之间的结合量产生关联)。在下文列出的实施例中，使用elisa方法，其中使用分光光度分析来测量结合量。然而，可以使用任何合适的分析方法。

24、如本文所用，术语“预定截断值”意指在统计学上经确定指示患者的疾病(即癌症)或其特定严重程度的高可能性的结合量，因为患者样品中的靶肽的测量值等于或高于统计学截断值，对应于所述疾病或其所述特定严重程度的存在的至少70％概率、优选地至少75％概率、更优选地至少80％概率、更优选地至少85％概率、更优选地至少90％概率并且最优选地至少95％概率。

25、如本文所用，术语“跟正常健康受试者相关联的值”意指通过上文所述的方法针对来自被认为是健康(即，没有疾病(或者更特别地，没有癌症))的受试者的样品确定的标准化结合量；并且术语“跟已知疾病严重程度或进展相关联的值”意指通过上文所述的方法针对来自已知患有已知严重程度的疾病(即癌症)的患者的样品确定的标准化结合量。

26、如本文所用，术语“单克隆抗体”是指完整抗体和保留完整抗体的结合特异性的其片段，例如fab片段、f(ab’)2片段、单链fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。众所周知，完整抗体通常具有两对同一的多肽链的“y形”结构，每对由一条“轻”链和一条“重”链组成。每个轻链和重链的n末端区域含有可变区，而每个重链和轻链的c末端部分组成恒定区。可变区包含三个互补决定区(cdr)，它们主要负责抗原识别。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。保留结合特异性的抗体片段至少包含cdr和可变区的其余部分的足够部分以保留所述结合特异性。

27、在本发明的方法中，可以使用包含本领域已知的任何恒定区的单克隆抗体。在小鼠抗体和人抗体的情况下，恒定轻链被归类为κ或λ轻链。重恒定链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。igg同种型具有几个亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4(在人的情况下)和igg1、igg2a、igg2b、igg2c和igg3(在小鼠的情况下)。单克隆抗体可以优选地具有igg同种型，包括igg亚类中的任一种。

28、抗体的cdr可以使用本领域已知的方法、诸如kabat等人所述的方法来确定。可以由b细胞克隆生成抗体。抗体的同种型可以通过对igm、igg或iga同种型或亚类具有特异性的elisa来确定。生成的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术来确定。例如，可以从细胞中分离出rna，并且使用rna通过逆转录来生成cdna。然后使用扩增抗体重链和轻链的引物对cdna进行pcr。例如，对所有vh(可变重链)序列的前导序列具特异性的引物可以与结合至位于先前确定的同种型的恒定区中的序列的引物一起使用。可以使用与κ或λ链的3’末端结合的引物以及退火至vκ或vλ前导序列的引物来扩增轻链。可以生成全长重链和轻链并对其进行测序。

29、在第三方面，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：

30、(a)对来自所述患者的样品进行根据本发明的第一或第二方面的免疫测定方法，以便检测所述患者是否患有癌症；以及

31、(b)如果在步骤(a)中确定所述患者患有所述癌症，则对所述患者施用用于治疗所述癌症的疗法。

32、所述疗法可以是适合于治疗相关癌症的任何疗法。所述疗法可以例如包括以下或由以下组成：一种或多种手术、一种或多种放射疗法、一种或多种药物(例如像一种或多种化学疗法、一种或多种免疫疗法和/或一种或多种激素疗法)或其组合。药物可以配制成局部或全身性施用。局部用药物可以例如配制成霜膏、泡沫、凝胶、洗剂或软膏进行施用。全身性药物可以例如配制成肠内或肠胃外施用。手术可以是治愈性手术、预防性手术、减积手术、姑息性手术和/或恢复性手术。

33、例如，在癌症是膀胱癌的情况下，合适的疗法可包括以下一种或多种：经尿道膀胱肿瘤切除术(turbt)伴有或不伴有膀胱内化学疗法或免疫疗法；根治性膀胱切除术加新辅助化学疗法或经尿道切除术伴有化学放射或部分膀胱切除术加新辅助化学疗法；基于顺铂的化学疗法，任选地随后进行根治性膀胱切除术或化学放射；基于卡铂的化学疗法；免疫检查点抑制剂；根治性膀胱切除术；和姑息性放射疗法。

34、在癌症是乳腺癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：乳房切除术(mastectomy)、象限切除术(quadrantectomy)或肿块切除术(lumpectomy)；雌激素受体阻断剂(诸如他莫昔芬)；阻断雌激素产生的芳香酶抑制剂(诸如阿那曲唑或来曲唑)；cdk抑制剂；一种或多种化学治疗剂，诸如环磷酰胺、多柔比星和任选的紫杉烷(诸如多西他赛)的组合，或环磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶的组合；一种或多种单克隆抗体，诸如曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗；和放射疗法。

35、在癌症是结直肠癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：内窥镜粘膜切除术或内窥镜粘膜下剥离术；部分结肠切除术(或针对直肠病变的直肠结肠切除术)；化学疗法剂，例如像卡培他滨、氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂或uft；抗血管生成药物，例如像贝伐单抗(bevacizumab)；表皮生长因子受体抑制剂，例如像阿柏西普(aflibercept)、西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)；放射疗法；免疫检查点抑制剂；和单克隆抗体，诸如派姆单抗(pembrolizumab)或多塔利单抗(dostarlimab)。

36、在癌症是头颈部癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：手术，包括但不限于激光手术；放射疗法，包括但不限于3d适形放射疗法、调强放射疗法、粒子束疗法和近距离疗法；一种或多种化学疗法剂，例如像紫杉醇、卡铂、西妥昔单抗、多西他赛、顺铂和氟尿嘧啶；利用amphinex的光动力疗法；单克隆抗体，诸如西妥昔单抗、贝伐单抗、厄洛替尼(erlotinib)、派姆单抗或纳武单抗(nivolumab)；基因疗法，诸如gendicine；和免疫检查点抑制剂。

37、在癌症是肾癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：通过手术去除整个肾脏或部分去除肾脏；冷冻肿瘤或用高温处理它；生物疗法，诸如依维莫司(everolimus)、托瑞赛(torisel)、多吉美(nexavar)、索坦(sutent)、阿西替尼(axitinib)、舒尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、卡博替尼(cabozantinib)和/或乐伐替尼(lenvatinib)；使用干扰素和/或白介素-2的免疫疗法；单克隆抗体，诸如纳武单抗；免疫检查点抑制剂；和放射疗法。

38、在癌症是肝癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：部分手术切除；肝移植；经皮消融术，包括将化学物质(乙醇或乙酸)注射至肝脏中或使用射频消融术、微波、激光或冷冻疗法产生极端温度；经动脉化疗栓塞术；使用索拉非尼的靶向疗法；经动脉放射栓塞术；内部放射疗法；光动力疗法；化学疗法诸如吉西他滨和/或顺铂；和姑息性放射疗法。

39、在癌症是肺癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：手术，诸如进行肺叶切除术、亚肺叶切除(楔形切除)或去除整个肺(肺切除术)；放射疗法，其实例包括与化学疗法一起给予的放射疗法、术后放射疗法、直接在气道内给予的近距离放射疗法(局部放射疗法)、预防性颅脑照射、立体定向放射和姑息性放射疗法；使用例如一种或多种药剂诸如顺铂/卡铂、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、拓扑替康(topotecan)、伊立替康和培美曲塞的化学疗法；表皮生长因子受体(egfr)抑制剂药物，诸如厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼(afatinib)、达克替尼(dacomitinib)或奥斯替尼(osimertinib)；和免疫疗法，所述免疫疗法使用例如抗pd-l1单克隆抗体诸如阿特珠单抗(atezolizumab)、纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗，靶向细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)的单克隆抗体诸如伊匹单抗(ipilimumab)和/或靶向血管内皮生长因子诸如贝伐单抗的单克隆抗体。

40、在癌症是黑色素瘤的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：手术切除肿瘤，以及任选地切除肿瘤区域中的淋巴结；干扰素治疗；使用例如像达卡巴嗪(dacarbazine)的药剂进行化学疗法；小分子靶向疗法，所述分子靶向疗法使用例如braf抑制剂(诸如威罗非尼(vemurafenib)和达拉菲尼(dabrafenib)、mek抑制剂(曲美替尼(trametinib))、c-kit抑制剂和/或nras抑制剂；使用细胞因子(例如il-2和/或ifn-α)、免疫检查点抑制剂(例如像抗ctla-4单克隆抗体诸如伊匹单抗或曲美木单抗，toll样受体(tlr)激动剂，cd40激动剂，抗pd-1抗体诸如派姆单抗、皮地利珠单抗(pidilizumab)或纳武单抗(nivolumab)、lag-3抑制剂诸如瑞拉利单抗(relatlimab)，和/或pd-l1抗体，和/或过继细胞转移(使用例如预刺激、修饰的t细胞或树突状细胞)细；和放射疗法。

41、在癌症是卵巢癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下中的一种或多种：去除一个卵巢(单侧卵巢切除术)或两个卵巢(双侧卵巢切除术)，并且任选地还切除输卵管(输卵管切除术)、子宫(子宫切除术)和/或大网膜(大网膜切除术)；减积手术；使用诸如紫杉醇、顺铂、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、吉西他滨、卡铂、多西他赛、长春新碱、更生霉素、依托泊苷、环磷酰胺、奥沙利铂或其组合的药剂的化学疗法(包括新辅助或辅助化学疗法)；放射疗法；激素疗法；和免疫疗法，例如像抗体药物贝伐单抗。

42、在癌症是胰腺癌的情况下，合适的疗法可以例如包括以下一种或多种：手术切除；使用诸如吉西他滨、5-fu、厄洛替尼、folfirinox、白蛋白结合型紫杉醇或其组合的药剂的化学疗法；放射疗法；生长抑素类似物类药物；兰瑞肽(lanreotide)；使用依维莫司或舒尼替尼的靶向疗法；用放射性标记肽或激素(诸如碘苄胍)的核医学疗法；以及诸如射频消融术(rfa)、冷冻消融术或肝动脉栓塞术的技术。

43、在癌症是前列腺癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：放射疗法；使用化学治疗剂，例如像多西他赛、卡巴他赛、多西他赛、沙利度胺及其组合的化学疗法；免疫疗法，例如像单克隆抗体贝伐单抗；激素疗法，例如像阿比特龙(abiraterone)和恩杂鲁胺(enzalutamide)；外束放射疗法；粒子疗法；高强度聚焦超声；冷冻疗法；和外科手术，例如像根治性前列腺切除术。

44、在癌症是胃癌的情况下，合适的疗法可例如包括以下一种或多种：外科手术，例如像内窥镜粘膜切除术、内镜粘膜下剥离术或胃切除术；使用诸如氟尿嘧啶、卡培他滨、bcnu、甲基-ccnu和多柔比星、丝裂霉素c、顺铂、taxotere或其组合的药剂的化学疗法；使用表皮生长因子受体2抑制剂诸如曲妥珠单抗的靶向疗法；和放射疗法。