一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法及其应用与流程

本技术涉及评价化妆品原料功效，尤其是涉及一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法及其应用。

背景技术：

1、目前，修护类化妆品原料修护功效的测定一般通过细胞、皮肤模型实验进行，通过测定与皮肤屏障相关的蛋白或物质进行评价。而皮肤血管生成的过程为从已存在的血管中形成新的血管，是组织修复、扩张和重塑的标志，不能全面准确对原料进行修护功效测定。

2、血管生成(angiogenesis)是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。多种类型的内皮细胞均可用于本实验。血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化是新生血管形成过程中的关键环节，并且受到vegf的调控直接抑制血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化，是研究血管生成有效的靶点。血管形成实验(tube formation assay)是体外研究血管生成的经典方法，该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路。多种类型的内皮细胞均可用于本实验，包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞(huvec)、小鼠3b-11细胞、小鼠svec4-10细胞和原代内皮细胞。血管形成实验(tube formation assay)是体外研究血管生成的经典方法，包括：1、基质胶预冷准备；2、铺胶：培养板提前预冷，基质胶加入培养板中，置于细胞培养箱凝固；3、收集细胞:胰酶消化细胞，计数后用培养基重悬细胞并调整细胞密度；4、铺板：取出基质胶凝固后的培养板，加入一定体积细胞悬液(含不同浓度的样品)，细胞培养箱常规培养；6、细胞培养一定时间后，在镜下观察并拍照，数据分析，比较样品对血管形成的抑制作用。该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路。体外的血管形成实验能很好的模拟肿瘤的血管发生过程，用于研究药物对这一过程的影响实验。该实验主要应用在医药研发领域，用于筛选药物对血管的抑制作用，评估药物对肿瘤潜在的抑制作用。

3、现有技术模型血管为自然生成，培养条件适于血管的形成，形成的血管完整，用于测试样品抑制血管形成的能力。对于样品对血管生成或修复的促进作用，现血管生成模型检测灵敏度低，无法用于化妆品原料对于血管形成的促进作用的筛选。故现模型用于血管生成抑制的研究，而非对血管的修复作用；化妆品原料有着安全性的要求前提，相关活性成分含量更低，故该模型不能用于化妆品原料靶向血管生成的修护作用的筛选。

4、化妆品原料功效研究常采用刺激诱导模型，以模拟研究外界或生理刺激条件下的样品的功效。血管形成实验不能直接用于刺激模型研究，目前也没有研究发现血管形成实验化妆品原料功效研究的报道。

5、因此，亟需一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法，以评价原料对血管修复的作用。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法及其应用。本技术考虑到需要对化妆品原料的血管受损后的促修复作用进行评估，本技术对血管形成的实验条件进行调整，添加诱导刺激条件，使血管模型适用化妆品领域修护功效研究。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、本技术提供了一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法，包括以下步骤：

4、s1、将含有待测化妆品原料的内皮细胞培养基悬液培养，辐照诱导刺激，获得待测混合物；

5、s2、检测待测混合物的a值和b值，用于展示血管形成完整度；

6、s3、将所述a值和b值与预设目标参数范围进行比较，根据比较结果评价化妆品原料修护功效；

7、a值＝血管面积/主干长度；

8、b值＝血管面积/分支长度。

9、本技术通过对人体皮肤血管常见外界刺激调研，基于血管形成实验，对血管模型进行条件调整及结果分析等进行了开发研究，构建了上述血管模型，用于化妆品原料功效筛选和验证。

10、本技术利用uva刺激体外内皮细胞形成的血管模型，化妆品原料缓解血管形成过程受阻，进而评价化妆品原料对血管修复的有益作用。

11、本技术构建的血管模型，采用血管面积/主干长度和血管面积/分支长度，用于展示血管形成完整度，避免单一指标分析结果不科学、客观的情况，评价了化妆品原料对血管修复的作用，验证了原料靶向血管修复的修护功效。

12、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述预设目标参数范围为：a值为1～100；b值为1～200。

13、本技术对构建的血管模型的血管面积/主干长度和血管面积/分支长度，可以用于展示血管形成完整度。同时，对比原基础模型样品检测结果，比较样品组与模型组两个参数的变化，进而对化妆品原料修护功效研究。

14、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞、小鼠3b-11细胞、小鼠svec4-10细胞和原代内皮细胞中的至少一种。

15、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述内皮细胞的细胞密度为1×104～5×105/孔。

16、本技术基于体外血管形成模型，使用市场化的人脐静脉内皮细胞(huvec)，研究中确定血管生成细胞密度，确定用于实验检测的稳定条件；确定了血管模型成立的基本条件。

17、本技术验证了不同细胞密度(细胞密度为1×104～5×105/孔)下血管模型实验均成立。

18、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述步骤s1中，所述辐照诱导采用紫外线诱导，诱导时间为0.5h～2h。

19、本技术在构建体外血管过程中添加uva(紫外线)刺激，建立可重复、稳定的模型，评价待测化妆品原料对血管修复的作用，确定结果分析方法，检测样品结果可重复，验证了待测化妆品原料靶向血管修复的修护功效。

20、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述步骤s1具体包括以下：

21、1)将基质胶加到底面积为1～10cm2的孔板中，轻摇铺满底部，细胞培养箱内孵育30～60min凝胶；

22、2)分别将含有待测化妆品原料和阳性对照的内皮细胞培养基悬液加入到培养板中；

23、3)培养0.5～1.5h后，辐照诱导刺激0.5h～2h，然后在细胞培养箱中继续培养；

24、4)8～24h后去除培养基，洗涤，显微镜观察，分析量化结果。

25、一些具体实施例中，所述内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞(huvec)，培养基为市售的人脐静脉内皮细胞(huvec)培养基。

26、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述孔板为48孔板或96孔板。

27、作为本技术所述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法的优选实施方式，所述阳性对照包括egf生长因子。

28、本技术还提供了上述评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法在筛选化妆品原料中的应用。

29、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

30、本技术提供了一种评价化妆品原料修护功效的血管模型构建方法及其应用，本技术在构建体外血管过程中添加uva(紫外线)刺激，建立可重复、稳定的模型，评价待测化妆品原料对血管修复的作用，确定结果分析方法，检测样品结果可重复，验证了待测化妆品原料靶向血管修复的修护功效。