一种脐带间充质干细胞hUC-MSCs纯度和群体倍增时间的测定方法与流程

本发明涉及干细胞检测，特别是涉及一种脐带间充质干细胞huc-mscs纯度和群体倍增时间的测定方法。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stromal/stem cell，msc)，是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)，具有多向分化潜能，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列的细胞分化潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。

2、间充质干细胞的多能性(multipotent)是指具有形成机体内超过一种类型细胞的能力，在体外可诱导分化为骨和脂肪等多种功能细胞，并能表达调控细胞向其他组织细胞类型或器官分化的基因特性(如ssea-4、oct-4、sox-2和nanog基因均为多能性基因)。间充质干细胞是以细胞分裂的方式产生新细胞的特性，包括细胞周期中各不同阶段所占比例以及细胞分裂过程中细胞数量随时间变化的特征。需要对脐带间充质干细胞huc-mscs的纯度和群体倍增时间进行检测，以把控间充质干细胞的质量要求。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞huc-mscs纯度和群体倍增时间的测定方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种脐带间充质干细胞huc-mscs纯度和群体倍增时间的测定方法，包括以下步骤：

4、1)将培养得到的脐带间充质干细胞huc-mscs与缓冲液混合，得到细胞悬液；

5、2)将所述步骤1)得到的细胞悬液与带荧光标记的抗体混合、孵育，得到孵育物；

6、3)将所述步骤2)得到的孵育物离心，将得到的沉淀清洗，再与缓冲液混合，得到待检测物，将所述代检测物检测细胞阳性表达比率；

7、4)将培养得到的脐带间充质干细胞huc-mscs与缓冲液、乙醇溶液混合，固定后得到固定物；

8、5)将所述步骤4)得到的固定物离心，将得到的沉淀与pi工作液混合、孵育、离心，将得到的沉淀清洗后，再与缓冲液混合，使用multicycle for dna软件分析群体倍增时间；

9、所述步骤1)～3)与步骤4)～5)之间无时间顺序限定。

10、优选的，所述脐带间充质干细胞huc-mscs的传代次数为3代至6代中的任一代。

11、优选的，所述步骤1)脐带间充质干细胞huc-mscs的数量与缓冲液的体积比为1×105个:0.5ml。

12、优选的，所述步骤2)细胞悬液与带荧光标记的抗体的体积比为100:1；

13、所述抗体的种类为抗人cd11b、cd14、cd19、cd34、cd45、cd73、cd90、cd29、cd44、cd105、hla-abc和hla-dr抗体中的一种或多种；

14、使用fitc或pe荧光标记抗体。

15、优选的，所述步骤2)孵育的条件包括：温度为4℃，时间为30min，避光孵育。

16、优选的，所述离心的条件包括：温度为4℃，时间为5min，转速为1200rpm。

17、优选的，所述步骤4)脐带间充质干细胞huc-mscs的数量与缓冲液的体积、乙醇溶液的体积比为1×105个:1ml:3ml；所述乙醇溶液的体积百分含量为75％。

18、优选的，所述步骤4)固定的条件包括：温度为4℃，时间为12～24h。

19、优选的，所述步骤5)pi工作液的终浓度为50μg/ml；

20、所述孵育的条件包括：温度为20～25℃，时间为30min，避光孵育。

21、优选的，所述缓冲液为pbs缓冲液。

22、本发明的有益效果为：

23、本发明利用流式细胞仪和对脐带间充质干细胞标记不同荧光素的单克隆抗体及pi染色，对细胞表面标志物及细胞周期进行分析，进一步确定了脐带间充质干细胞的纯度及群体倍增时间的检测方法。

技术特征：

1.一种脐带间充质干细胞huc-mscs纯度和群体倍增时间的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞huc-mscs的传代次数为3代至6代中的任一代。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1)脐带间充质干细胞huc-mscs的数量与缓冲液的体积比为1×105个:0.5ml。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)细胞悬液与带荧光标记的抗体的体积比为100:1；

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)孵育的条件包括：温度为4℃，时间为30min，避光孵育。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述离心的条件包括：温度为4℃，时间为5min，转速为1200rpm。

7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4)脐带间充质干细胞huc-mscs的数量与缓冲液的体积、无水乙醇溶液的体积比为1×105个:1ml:3ml；所述乙醇溶液的体积百分含量为75％。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4)固定的条件包括：温度为4℃，时间为12～24h。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤5)pi工作液的终浓度为50μg/ml；

10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述缓冲液为pbs缓冲液。

技术总结本发明涉及干细胞检测技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞hUC‑MSCs纯度和群体倍增时间的测定方法。将培养得到的脐带间充质干细胞hUC‑MSCs与缓冲液混合，得到细胞悬液；将细胞悬液与带荧光标记的抗体混合、孵育，得到孵育物；将孵育物离心，将得到的沉淀清洗，再与缓冲液混合，得到待检测物等。本发明利用流式细胞仪和对脐带间充质干细胞标记不同荧光素的单克隆抗体及PI染色，对细胞表面标志物及细胞周期进行分析，进一步确定了脐带间充质干细胞的纯度及群体倍增时间的检测方法。技术研发人员：里程,郭镭受保护的技术使用者：圣释（北京）生物工程有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/25