一种醛类分子质谱分析方法及其衍生试剂

本发明涉及分析化学，具体涉及一种醛类分子靶向或非靶向质谱分析技术，特别是生物样品中醛类分子质谱分析的同位素标记衍生化方法及组合型衍生试剂。

背景技术：

1、醛类小分子代谢物广泛存在于人体和生物体，并深度参与糖酵解、激素合成等生命活动。生命有机体中的醛类主要可分为脂肪醛、芳香醛、多元醛和不饱和醛等，醛类绝大多数为细胞脂质反应、脂质氧化或自由基损伤过程中产生，被认为可以成为重大疾病的潜在标志物，比如肿瘤、动脉粥状硬化、神经退行性疾病等。

2、由于醛类化合物自身物理化学性质和样品大量基质干扰存在，对它们进行分析和表征存在巨大的分析挑战。醛类化合物的分析检测方法主要有传感分析法、电化学法、荧光成像、色谱法、质谱法、色谱-质谱联用法等。高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)或气相色谱-串联质谱(gc-ms/ms)技术，由于其灵敏度高、特异性强、动态范围宽的优势，是众多内源性代谢物和外源性污染物的常用分析方法。cn200810141097利用二苯胺、2，5－二羟基苯甲酸、乙二醇配制用于小分子醛类物质衍生化的试剂，通过maldi实现了对烟草中醛类化合物进行定性或定量检测，对甲醛和丙烯醛的检测限可达到fmol级。

3、代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，在临床医学领域具有广泛的应用前景。代谢组学分析技术包括：nmr、gc-ms、ce-ms、lc-ms，这些技术虽然在一定程度上都能检测出代谢物，但是仍然存在诸多困难，如代谢物离子化效率低、质谱信号弱、定量缺少同位素内标、检测到的代谢物数量少、干扰多等问题。对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。而且，质谱(ms)并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化，因此出现测不准问题。

4、在代谢组学靶向质谱分析方法中，通过复杂的样品前处理净化步骤和使用昂贵的同位素内标，往往能精准测量一类或几类已知代谢物。非靶向质谱分析方法通过牺牲灵敏度来保留广泛的分析物覆盖范围，这使得该方法在测量低浓度代谢物方面效果很差。近年来，轻/重同位素标记衍生化技术的出现能够改善代谢组和暴露组液相色谱-质谱靶向和非靶向分析工作中的诸多问题。cn202110480349对羰基类代谢物用具有12c标记/13c标记的丹磺酰肼进行衍生化，提高了代谢物检测的灵敏度，可同时检测到更多的代谢物。尽管如此，现有技术中仍然存在同位素标记试剂匮乏、难于合成或纯化，衍生化反应不够温和与快速，衍生物二级质谱碎裂特异性不强，氢/氘同位素标签带来色谱同位素效应等问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中醛类小分子同位素标记衍生化试剂匮乏、难于合成/纯化、使用成本高等瓶颈问题，以及非靶分析假阳性高，质谱灵敏度不高、一级和二级质谱特异性低等技术难题。本发明提供一种基于溴代菲醌和14n/15n同位素标记衍生化技术的醛类靶向与非靶向质谱分析方法。使用3-溴-9,10-菲醌和14n/15n-乙酸铵对醛类小分子进行同位素标记衍生化，生成的衍生产物含溴元素，79br:81br约为1:1的特征同位素峰为质谱的定性/定量带来极高的特异性，能够显著降低假阳性或假阴性结果。同时，14n/15n同位素质量差异标签带来的轻/重同位素标记策略，能够为靶向质谱分析提供内标，为非靶向质谱分析提供便捷可信的定性鉴定能力。

2、具体而言，本发明提供以下技术方案：

3、一方面，本发明提供一种代谢产物质谱分析方法，其特征在于，将生物样品中的醛类代谢产物使用3-溴-9,10-菲醌和14n/15n-乙酸铵在酸性溶剂下进行衍生化，然后进行质谱检测。

4、进一步，本发明所述的代谢产物质谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

5、(1)醛类代谢产物的提取：从生物样品中获得醛类代谢产物提取液，所述生物样品包括人体组织样品或体液样品，优选为人体血浆、尿液、肺组织；

6、(2)醛类代谢产物的衍生化：将过量的3-溴-9,10-菲醌乙腈溶液加入到醛类代谢产物提取液中，再加入14n/15n-乙酸铵乙酸溶液，对醛类分子进行同位素标记；

7、(3)对步骤(2)的同位素标记产物进行质谱分析，获得生物样品中醛类代谢物的定性/定量信息。

8、另一方面，本发明提供一种醛类分子高效标记方法，其特征在于，以3-溴-9,10-菲醌和14n/15n-乙酸铵作为组合同位素标记衍生化试剂，在乙酸的存在下实现醛类小分子的高效标记。

9、进一步，本发明所述醛类分子高效标记方法，其特征在于，反应式如下：

10、

11、其中，-r为烷基、苯烷基、羟基取代的烯基。优选的，-r具有1-12个碳原子数。

12、进一步，本发明所述醛类分子高效标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

13、(1)将3-溴-9,10-菲醌固体溶于溶剂中，将14n-乙酸铵固体和15n-乙酸铵固体分别溶于乙酸中；

14、(2)将过量的3-溴-9,10-菲醌溶液加入到醛类分子溶液中，再加入14n-乙酸铵溶液和15n-乙酸铵溶液中的一种，涡旋混匀；

15、(3)恒温水浴反应获得同位素标记的醛类衍生产物。

16、优选地，所述同位素标记衍生化反应中，3-溴-9,10-菲醌与醛类化合物的摩尔比为1500:1-5000:1，在此摩尔比范围将会获得最优的同位素标记衍生化反应效率。更优选地，式(1)所示的3-溴-9,10-菲醌与醛类化合物的摩尔比为2500:1。

17、优选地，所述同位素标记衍生化反应中，按摩尔比计，14n/15n-乙酸铵为3-溴-9,10-菲醌的100-10000倍。更优选地，14n/15n-乙酸铵为3-溴-9,10-菲醌的3000倍。

18、进一步，本发明所述醛类分子高效标记方法，其特征在于，在醛类分子的靶向定量检测中，待测样品和标准样品在衍生化反应中采用的乙酸铵具有不同的n同位素；

19、如待测样品与3-溴-9,10-菲醌、14n-乙酸铵反应，则标准样品与3-溴-9,10-菲醌、15n-乙酸铵反应；

20、如待测样品与3-溴-9,10-菲醌、15n-乙酸铵反应，则标准样品与3-溴-9,10-菲醌、14n-乙酸铵反应。

21、进一步，本发明所述醛类分子高效标记方法，其特征在于：

22、步骤(1)中的溶剂选自乙腈、甲醇、乙酸中的一种或多种；

23、步骤(2)中醛类分子的浓度为0.01-1μmol/l、3-溴-9,10-菲醌浓度为0.5-3mmol/l、醋酸铵浓度为1-3mol/l；

24、步骤(3)的反应温度为60-98℃、反应时间为3-30min。

25、进一步，本发明所述醛类分子高效标记方法，其特征在于：

26、步骤(1)中的溶剂是乙腈：乙酸(v:v)为9:1的混合溶剂；

27、步骤(2)中醛类分子的浓度为0.1μmol/l、3-溴-9,10-菲醌浓度为1mmol/l、醋酸铵浓度为2mol/l；

28、步骤(3)的反应温度为90℃、反应时间为15min；

29、其中，所述醛类分子包括己醛、庚醛、苯甲醛、4-羟基壬烯醛(4-hne)中的一种或多种。

30、另一方面，本发明提供一种用于醛类分子质谱分析预处理或衍生化的试剂，其包括：3-溴-9,10-菲醌、14n-乙酸铵、15n-乙酸铵。

31、另一方面，本发明提供一种醛类衍生物，其具有以下结构式：

32、

33、其中，

34、-r为具有1-12个碳原子的烷基、苯烷基、羟基取代的烯基；

35、n原子为14n或15n。

36、为更清楚的说明本发明的技术方案，进一步结合本发明中醛类分子衍生化的化学反应机理描述如下：

37、

38、本发明提供了一种轻/重同位素标记试剂组合策略，其中，该同位素标记衍生化分析策略以14n/15n-乙酸铵和3-溴-9,10-菲醌作为组合衍生化试剂在酸性条件下与醛类小分子反应为基础，所述3-溴-9,10-菲醌的结构式如下式(1)所示，轻/重同位素试剂醋酸铵的结构式如下式(2)所示：

39、

40、本发明还提供了一种上述衍生化组合策略的同位素标记衍生化反应条件和操作过程，其中，包括：所述同位素标记衍生化反应如下式(3)所示，实验操作中用14n-乙酸铵反应体系对具体的单个实际样品进行标记，用15n-乙酸铵反应体系对标准品(靶向分析)或样品池样品(pooled sample，非靶向分析)进行标记，标记产物按照1:1体积比混合后进样分析。

41、

42、所述的实验操作中，其中醛类小分子标准品包括戊醛、己醛、庚醛、十一醛、苯甲醛、4-羟基壬烯醛(4-hne)中的一种或多种；单个实际样品包括人体组织样品或体液样品，优选为肺癌患者血清、尿液、肺组织等。

43、所述的实验操作中，所用的溶剂为乙腈、甲醇、乙酸中任一种溶液，优选乙腈和乙酸(比例9:1)；3-溴-9,10-菲醌浓度为0.5mmol/l-3mmol/l，优选为1mmol/l；醋酸铵浓度为1mol/l-3mol/l，优选为2mol/l。

44、所述的实验操作中，反应温度为60-98℃，优选为90℃；反应时间为3-30min，优选为15min。

45、本发明还提供了一种基于溴代菲醌和14n/15n同位素标记衍生化技术的醛类靶向与非靶向质谱分析方法的实际样品应用。所开发的组合同位素标记衍生化反应以及液相色谱-质谱的高灵敏度、准确度、快速和成本效益使其成为分析人体样本中脂肪醛、芳香醛、不饱和醛等的理想选择。此外，本发明应用测定了健康人的血清、血浆、尿液中醛的含量，并将肺癌患者作为对照组，不仅实现了三重四极杆质谱的靶向定量，也在高分辨质谱定性鉴定方面对脂肪醛进行了非靶向的识别。在实际样品前处理方面，首先，保持人体样品的少量稀释，从而确保所研究的醛在痕量水平上的检测，其次，通过使用少量的15n-乙酸铵来支持该方法的成本效益。

46、本发明反应式(3)所示的衍生化体系可对醛类小分子化合物进行衍生，用于提高醛类小分子化合物的电喷雾离子源质谱检测(esi-ms)的信号强度。具体地，所述反应式(3)所示的同位素标记衍生化组合策略用于醛类小分子的电喷雾离子源质谱检测的步骤包括：

47、(1)、在1.5ml离心管中依次加入200μl结构式(1)所示的化合物(浓度1mmol/l)，100μl结构式(2)所示的化合物重标15n-乙酸铵(浓度2mmol/l)和100μl分析物醛类小分子溶液(0.1μmol/l)。

48、(2)、在1.5ml离心管中依次加入200μl结构式(1)所示的化合物(浓度1mmol/l)，100μl结构式(2)所示的化合物轻标14n-乙酸铵(浓度2mmol/l)和100μl分析物实际样品溶液。

49、(3)、以上两管溶液在90℃水浴反应15min，衍生化反应结束后，取体积比(v/v)1:1混合。

50、(4)、用乙腈稀释混合液，进高效液相色谱-电喷雾质谱(hplc-esi-ms)检测。

51、本发明的优点和有益效果：

52、本发明在同位素标记衍生试剂中引入溴天然同位素，两种天然同位素79br与81br丰度比值接近1:1，这种独特的br同位素特征能够帮助实现衍生化产物的快速识别，为靶向定量和非靶向鉴定提供了强力技术支撑。本发明14n和15n轻/重同位素标记策略所用同位素来源为乙酸铵，容易购买且价格实惠，使用成本低，配合br同位素特征共同使用，能够为靶向定量和非靶向识别带来更高的质谱分析性能。

53、(1)本发明使用3-溴-9,10-菲醌和14n/15n-乙酸铵对醛类小分子进行同位素标记衍生化，生成的衍生产物含溴元素，79br:81br约为1:1的特征同位素峰为质谱的定性/定量带来极高的特异性，能够显著降低假阳性结果。

54、(2)本发明引入14/15n的醋酸铵，无需繁琐、昂贵和耗时的制备过程，该试剂容易购买且价格实惠，使用成本低，此外，它将避免在使用氢/氘同位素对时出现的色谱同位素效应。配合br同位素特征共同使用，能够为靶向定量和非靶向识别带来更高的质谱分析性能。

55、(3)本发明所用衍生化试剂与醛类小分子代谢物的衍生化产物稳定，在质谱子离子扫描分析中，能够产生丰度高的特异性碎片离子，为质谱定量和定性识别提供依据，因此具有良好的靶向和非靶向分析应用价值。