一种实现病毒RNA特异性检测的微流控-SERS的原位检测方法

本发明属于生化分析仪器领域，主要涉及一种实现病毒rna特异性检测的微流控-sers的原位检测方法。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒作为一种世界性流行病原体，是引起全球婴幼儿、免疫功能不全及老年人急性呼吸道感染的最常见病毒，每年平均感染3400万儿童，其中约有340万儿童需要住院治疗，约有20万人不幸死亡。在婴幼儿出生以后的第一年的感染率就已达68.8％，第二年则达82.6％；并且，老年人和免疫缺陷人群rsv感染后也会伴随并发症及死亡病例，导致高住院率和高死亡率的发生。但目前仍无疫苗上市，唯一获准用于预防rsv感染的单克隆抗体帕利珠，因用量大、费用高等原因，仅限用于预防免疫缺陷和先天心肺疾病等高危新生儿的感染。呼吸道合胞病毒的快速检测可以使医生能在病毒感染的早期就进行治疗，从而有效减轻治疗成本及对健康的影响。

2、1928年，c.v.raman首次发现了拉曼散射现象。当光(自然光或者激光)照射到一些物质的表面时，会出现散射光。拉曼散射的形成原因主要是光子与分子之间的互相影响，比如分子键的振动、转动或者偏移等。因此，特定分子的拉曼散射信号是固定的，拉曼信号可以看成是特定分子的“指纹峰”。拉曼光谱具有能带谱窄、所需样本少、不受水的干扰等特点，是一种良好的生化样本检测技术。但拉曼光谱的散射截面非常小，其散射光强度约为入射光强度的10-10，导致信号极弱，因此拉曼光谱很难检测低浓度的样品分子。1974年，fleischmann等人偶然发现粗糙银电极可以增强拉曼信号，放大倍数约为103～104倍，甚至具有单分子探测能力，这种现象被称为表面增强拉曼散射(surface enhanced ramanscattering，sers)效应。sers具有出色的分辨率、超高的灵敏度、以及可以快速、无损的检测样品的能力，在病原微生物检测、生物医学成像和诊断、环境污染物检测、生物分析、单分子光谱等领域的应用非常广泛。

3、微流控技术是在微通道中制作微元器件，例如微阀、微泵、微检测、微电极等器件或结构，可以在微通道中操作微量样品，是一种用于分析或处理微量样品的多功能技术。微流控芯片可以并行处理大量样本，具有高通量，低材料消耗，低污染性的特点，近年来，微流控技术发展迅速，广泛应用于多种领域，在细菌、真菌和细胞等研究中展现出极大的优势和潜力。近年来，人们发现在微流控芯片上集成sers分析模块从而实现微流控芯片分析平台与sers光谱分析技术的有机结合，能够有效解决生化样品分析中sers检测灵敏度低、信号重现性差及样本在敞开体系中易被污染等问题，并能实现仅在微升甚至纳升的生化液体中靶标物的快速灵敏检测。此外，微流控芯片还能高度模拟细菌的培养条件和生活环境，同时实施细菌的分选、培养和分离等预处理操作，并结合sers检测技术实现对细菌的高灵敏度无损探测，获取更多细菌的拉曼光谱信息。微流控芯片可以作为一个集成平台，使sers检测更具重现性、高效、安全和环保。

4、因此，本工作将为微流控芯片与sers检测技术结合，提出了一种实现病毒rna特异性检测的微流控-sers的原位检测方法；意在将sers对细菌微生物的特异性筛选检测能力与微流控芯片的精准控制和集成能力相结合，实现在短时间内病毒rna的特异性检测。

技术实现思路

1、本发明目的在于解决传统病毒rna检测技术存在耗时长、检测过程复杂，难以实现快速检测病毒，完成临床诊断的难题。为此，本发明提出将微流控芯片与拉曼光谱检测技术相结合，利用sers检测，实现了病毒rna的原位检测，提高诊断效率。

2、根据本发明实施例的一种实现病毒rna特异性检测的微流控-sers的原位检测方法，至少具有如下有益效果：本发明利用微流控芯片实现病毒的分离等预处理操作，在结合贵金属介观材料基底和sers光谱分析仪，实现病毒rna的特异性检测。

3、根据本发明实施例的一种实现病毒rna特异性检测的微流控-sers的原位检测方法，包括微流控芯片，四氧化三铁纳米球，纳米金星，二氧化硅，pdna，拉曼光谱检测系统，霍尔线圈，电源模块，主控模块，pc机。

4、根据本发明的一些实施例，实现拉曼信号增强，作为sers检测基底基础的为四氧化三铁纳米球和纳米金星；

5、根据本发明的一些实施例，修饰四氧化三铁纳米球和纳米金星的为二氧化硅；

6、根据本发明的一些实施例，将病毒rna富集到贵金属介观材料基底表面的为pdna；

7、根据本发明的一些实施例，对病毒rna进行sers检测的为拉曼光谱检测系统；

8、根据本发明的一些实施例，产生磁力，控制磁珠移动的为霍尔线圈；

9、根据本发明的一些实施例，为霍尔线圈提供电源的为电源模块；

10、根据本发明的一些实施例，控制电源模块产生不同大小的电流的为主控模块；

11、根据本发明的一些实施例，控制主控模块调节电源模块输出的为pc机；

12、根据本发明的一些实施例一种病毒rna特异性检测基底用四氧化三铁纳米球和纳米金星，其结构分别为球形结构和五边形结构，其具备较强的拉曼散射增强能力：制备好的四氧化三铁纳米球和纳米金星外包裹二氧化硅；在四氧化三铁纳米球作为介观材料的二氧化硅外偶联纳米银球和pdna1作为sers基底a，在纳米金星作为介观材料的二氧化硅外偶联pdna2作为sers基底b；sers基底a、b与目标检测物，也就是tdna形成卫星结构的多功能微球；使用倒光刻法和倒模法制备微流控芯片，其中包括入口、通道、sers基底、以及出口，使用微流控芯片可完成并病毒rna的培养和检测；打开由霍尔线圈、电源模块、主控模块以及pc机组成的总控系统产生控制磁珠运动的磁力，在将病毒和sers基底a、b通入微流控芯片后，打开拉曼光谱检查系统的光源，通过拉曼光谱检测系统的显微物镜实现目标增强后拉曼信号的采集与捕获，该装置具体实现过程如下所述：

13、微流控芯片有三个入口，一个出口。在其中一个入口通入待测物——病毒的rna，在另一个入口通入制备好的sers基底a，最后一个入口通入制备好的sers基底b，接着打开由霍尔线圈、电源模块、主控模块以及pc机组成的总控系统，通过pc机下发控制霍尔线圈产生不同大小的磁力，控制磁珠运动，带动待测物经过特殊设计的微流控芯片内的结构，使三种注入液混合，打开拉曼光谱检测系统的光源，对准微流控芯片上的sers检测区，对待测物进行拉曼检测，可得到病毒rna的sers信号，对测得的信号进行分析，就可完成病毒rna的特异性检测，同时废液从出口处排除。

14、本发明的技术效果和优点：

15、(1)本发明制备出了纳米金星结构的贵金属介观材料，解决传统球形贵金属介观材料sers增强效果差的问题。

16、(2)本发明使用外层包裹二氧化硅并偶联pdna来修饰贵金属介观材料，可将病毒rna与基底强吸附，实现病毒rna的富集。

17、(3)本发明将两种sers基底溶液与待检测目标溶液混合，可完成pdna1和pdna2对tdna的共同捕获，形成了卫星结构的多功能微球，完成多级增强的sers检测。

18、(4)本发明设计的病毒rna特异性检测方法，将微流控芯片与sers检测技术相结合，可快速、简便的对病毒rna实现痕量检测。

19、(5)本发明设计的总控系统可控制磁珠运动速度，实现基底溶液与待测目标液充分混合。