一种林麝香腺细胞冻存液及其制备方法与应用与流程

本申请涉及细胞及生物工程的，具体涉及一种林麝香腺细胞冻存液及其制备方法与应用。

背景技术：

1、林麝是一种哺乳动物，其香腺是一种特殊的腺体，能够分泌出具有浓郁香气的物质，被用于制作香料和药物等。林麝香腺细胞是构成香腺的基本单位，其形态和功能与香腺的生理特性密切相关。这些细胞能够合成和分泌特定的香气分子，从而赋予林麝独特的香味。对林麝香腺细胞的研究有助于深入了解林麝香气的产生机制和香腺的生理功能，为相关领域的研究提供理论基础。

2、目前，林麝香腺细胞制品的供需矛盾较为突出，因此，林麝香腺细胞的保存迫切需要达到以下目标：储存方法简便、长期大量保存、运输方便。细胞的保存通常涉及到细胞培养技术和细胞冷冻保存技术；然而现有技术中的冻存液并不适宜林麝香腺细胞的冻存。

技术实现思路

1、为了提高林麝香腺细胞冻存制品的存活率和功能，本申请提供一种林麝香腺细胞冻存液及其制备方法与应用。

2、本申请提供了一种林麝香腺细胞冻存液具体包括以下重量份的组分：65-75份dmem/f12、17-23份胎牛血清、6-11份二甲基亚砜、1.5-2.5份营养添加物；

3、所述营养添加物以dmem/f12培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：0.12-0.18mmol/l维生素a、180-220mmol/l l-谷氨酰胺、90-110mmol/l丙酮酸钠。

4、本申请提供的技术方案以维生素a、l-谷氨酰胺和丙酮酸钠作为林麝香腺细胞冻存液的营养添加物，维生素a可以维持冻干过程中的细胞形态，防止林麝香腺细胞在脱水干燥过程以及储藏过程中发生氧化变质；l-谷氨酰胺可以提供氮原子和蛋白质等必须氨基酸，维持细胞状态；丙酮酸钠作用是提供抗氧化、防止乳酸形成，从而达到保护活性组分的目的。

5、本申请的发明人发现以上述三种组分作为林麝香腺细胞冻存液的原料组分，在冷冻、脱水干燥失水等恶劣环境条件下，能在林麝香腺细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护林麝香腺细胞不发生变性失活，从而维持细胞的活性。

6、因此，本申请提供的林麝香腺细胞冻存液对林麝香腺细胞冻存具有出乎意料的保护作用，所得的林麝香腺细胞冻存制品安全性高，稳定性强，利于林麝香腺细胞的长期贮存和运输。

7、林麝香腺细胞冻存液中各组分浓度与林麝香腺细胞冻存过程中的保护直接相关，当浓度过小时，保护作用较弱；而当浓度达到一定的程度之后，对细胞的稳定作用能力达到极限，过高浓度反过来会使得脱水干燥过程中细胞发生变性，导致细胞活率降低。因此，本申请需要合理控制各原料组分的浓度为上述范围。

8、优选地，所述林麝香腺细胞冻存液具体包括以下重量份的组分：67-72份dmem/f12、18-22份胎牛血清、7-10份二甲基亚砜、1.7-2.3份营养添加物。

9、优选地，所述林麝香腺细胞冻存液具体包括以下重量份的组分：68-71份dmem/f12、19-21份胎牛血清、7.5-8.5份二甲基亚砜、1.9-2.1份营养添加物。

10、优选地，所述营养添加物以dmem/f12培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：0.13-0.17mmol/l维生素a、190-210mmol/l l-谷氨酰胺、95-105mmol/l丙酮酸钠。

11、优选地，所述营养添加物以dmem/f12培养基为溶剂，由以下浓度的组分组成：0.13-0.17mmol/l维生素a、190-210mmol/l l-谷氨酰胺、95-105mmol/l丙酮酸钠、20-40mmol/l醇类物质。

12、优选地，所述营养添加物中，所述醇类物质选自乙醇、甘油、山梨醇中的一种或多种。

13、优选地，所述营养添加物中，所述醇类物质由摩尔比为21-25：5-9的乙醇、山梨醇混合组成。

14、本申请利用醇类物质作为填充剂和低温保护剂，其在慢速冻结时会结晶，从而为细胞活性组分提供支撑结构，且不与活性组分发生反应，从而达到保护活性组分的目的，维持细胞的活性。

15、发明人发现，以上述特定的醇类物质作为营养添加物，能够迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓解冻过程，能使细胞内的水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内的冰晶，从而减轻复水过程对细胞的损伤，提高细胞的数量以及存活率。

16、第二方面，本申请提供了上述林麝香腺细胞冻存液在林麝香腺细胞中的应用。

17、第三方面，本申请提供了一种林麝香腺细胞冻存制品，利用上述林麝香腺细胞冻存液制得。

18、第四方面，本申请提供了上述林麝香腺细胞冻存制品的制备方法，具体包括以下步骤：将林麝香腺原代贴壁细胞消化处理后，加入所述林麝香腺细胞冻存液，转移至(-75)-(-85)℃进行超低温冷冻，冻存10-14h，然后取出转移至液氮罐内冻存。

19、综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：

20、本申请以含有0.12-0.18mmol/l维生素a、180-220mmol/l l-谷氨酰胺、90-110mmol/l丙酮酸钠放入dmem/f12培养基为营养添加物，与65-75份dmem/f12、17-23份胎牛血清、6-11份二甲基亚砜混合制备林麝香腺细胞冻存液。利用本申请提供的林麝香腺细胞冻存液对林麝香腺细胞进行冻存，细胞复苏后的细胞数量和细胞存活率较高。

21、本申请通过在营养添加物中加入特定用量特定种类的醇类物质，进一步提高了林麝香腺细胞冻存后的细胞数量和细胞存活率。

技术特征：

1.一种林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，具体包括以下重量份的组分：65-75份dmem/f12、17-23份胎牛血清、6-11份二甲基亚砜、1.5-2.5份营养添加物；

2.根据权利要求1所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，具体包括以下重量份的组分：67-72份dmem/f12、18-22份胎牛血清、7-10份二甲基亚砜、1.7-2.3份营养添加物。

3.根据权利要求2所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，具体包括以下重量份的组分：68-71份dmem/f12、19-21份胎牛血清、7.5-8.5份二甲基亚砜、1.9-2.1份营养添加物。

4.根据权利要求1所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，所述营养添加物以dmem/f12培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：0.13-0.17mmol/l维生素a、190-210mmol/l l-谷氨酰胺、95-105mmol/l丙酮酸钠。

5.根据权利要求1所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，所述营养添加物以dmem/f12培养基为溶剂，由以下浓度的组分组成：0.13-0.17mmol/l维生素a、190-210mmol/l l-谷氨酰胺、95-105mmol/l丙酮酸钠、20-40mmol/l醇类物质。

6.根据权利要求5所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，所述营养添加物中，所述醇类物质选自乙醇、甘油、山梨醇中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的林麝香腺细胞冻存液，其特征在于，所述营养添加物中，所述醇类物质由摩尔比为21-25：5-9的乙醇、山梨醇混合组成。

8.权利要求1-7任一项所述的林麝香腺细胞冻存液在林麝香腺细胞中的应用。

9.一种林麝香腺细胞冻存制品，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述的林麝香腺细胞冻存液制得。

10.权利要求9所述林麝香腺细胞冻存制品的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：将林麝香腺原代贴壁细胞消化处理后，加入所述林麝香腺细胞冻存液，转移至（-75）-（-85）℃进行超低温冷冻，冻存10-14h，然后取出转移至液氮罐内冻存。

技术总结本申请涉及细胞及生物工程的技术领域，具体公开了一种林麝香腺细胞冻存液及其制备方法与应用。本申请公开的林麝香腺细胞冻存液，具体包括以下重量份的组分：65‑75份DMEM/F12、17‑23份胎牛血清、6‑11份二甲基亚砜、1.5‑2.5份营养添加物；所述营养添加物以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下浓度的组分：0.12‑0.18mmol/L维生素A、180‑220mmol/L L‑谷氨酰胺、90‑110mmol/L丙酮酸钠。利用本申请提供的林麝香腺细胞冻存液对林麝香腺细胞进行冻存，细胞复苏后的细胞数量和细胞存活率较高。技术研发人员：安娴,姚丛学,廖丹丹,李鑫受保护的技术使用者：北京燕麝生物科技发展有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/1