一种细胞外囊泡-青蒿素装载物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物及美容护肤，特别涉及一种利用超声联合循环冻融的新方式制备并获得的细胞外囊泡-青蒿素装载物及其应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicle, ev)是一类由细胞主动释放的纳米级囊泡。细胞外囊泡具有脂质双分子层构成的膜结构，在细胞通讯中发挥重要作用，并参与多种生物学功能。相较于脂质体、微球等合成纳米颗粒，细胞外囊泡具有优异的生物相容性、较好的组织渗透性、天然的稳定性以及低免疫原性等优点，因此细胞外囊泡作为一类新型的生物载体受到研究者的广泛关注。

2、得益于细胞外囊泡独特的生物学特性，其在皮肤健康领域具有诸多优势。细胞外囊泡是细胞释放的微小膜结构，它们能够携带丰富的生物活性分子，如蛋白质、生长因子、细胞因子以及核酸等。这些活性分子在皮肤再生、修复、抗炎和抗氧化过程中发挥至关重要的作用。细胞外囊泡的脂质双层膜结构不仅保护这些活性分子免受外界环境的破坏，还有助于提高其生物利用度，促进它们能够有效地渗透作用区域。此外，细胞外囊泡的天然来源和低免疫原性还使得它们在美容护肤应用中具有较高的安全性和耐受性。细胞外囊泡的这些特性使它们在美容护肤领域中展现出极大的应用前景。

3、青蒿素是黄花蒿植物中的一种主要活性物质，是治疗疟疾效果最好的药物之一。此外，青蒿素具有较好的抗炎和抗菌功效，在化妆品领域也存在重要应用。青蒿素能够通过调节促炎因子来减轻肌肤发炎和红肿症状；青蒿素还具有广谱的抗菌活性，在体外试验中被证明其可以有效地杀灭多种细菌和真菌，并且不会产生耐药性。因此，青蒿素是一种非常适合敏感肌肤和易感肌肤的天然抗痘和抗炎成分。然而，青蒿素应用于化妆品中也存在水溶性差、角质层渗透率低、生物利用度不高等缺点。

4、一些青蒿素衍生物的研究试图提高天然青蒿素在适应症范围、效果、生物利用度等方面的优势，但这些衍生物表现出相对于青蒿素各有优劣的特性结果。例如双氢青蒿素将青蒿素结构中的c-10位羰基还原成羟基，抗疟效果较青蒿素提高了4到8倍，口服生物利用度较青蒿素提高了10倍，但二者整体的水溶性方面差异不大。同时，它们的作用机制和效果可能存在差异，例如，青蒿素的抗炎作用可能与其抗氧化特性和对细胞增殖和细胞因子释放的影响有关，而双氢青蒿素的抗炎作用机制更偏向通过调节炎症介质、免疫细胞以及多种信号通路，因此青蒿素能够通过更广泛的作用机制发挥抗炎作用。在美容护肤领域中，天然青蒿素更具信赖、可靠性和成本优势，其作用机制的广泛性还能够满足不同肤质的普适性要求。

5、在药物递送系统选择方面，青蒿素及其衍生物也由于化学结构、物理化学性质、以及与载体分子作用方式等差异，而显示出不同的策略差异和效果。例如，双氢青蒿素虽然具有更好的化学稳定性，这使得它可以用于更广泛的药物递送系统而不易分解，但研究发现双氢青蒿素可能在某些肿瘤组织或酸性环境中表现出不同的释放行为。由于青蒿素的结构特性，使得它相对于青蒿素衍生物的稳定性和装载性等方面局限度更高，对载体材料和装载方法提出了更高的要求，需同时考虑装载过程中过氧化物桥的稳定性问题、溶解度问题、与载体分子的相互作用问题、以及释放性问题，以确保青蒿素能够通过药物递送系统的设计和优化，在美容护肤领域发挥更高的有效性和安全性。

6、为此，提出本技术。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的上述问题，本发明基于细胞外囊泡的递送技术，结合现有装载技术的优势和不足，综合考虑青蒿素和细胞外囊泡的结构和生物特性，创造性提出了一种超声联合循环冻融装载策略，成功利用细胞外囊泡对青蒿素进行有效装载，提升青蒿素透过角质层的能力，并在美容护肤方面发挥了协同增效的效果。

2、第一方面，本发明提供了一种细胞外囊泡-青蒿素装载物的制备方法，包括下述步骤：对含有细胞外囊泡、青蒿素和保护剂的混合液依次进行超声、冻融，循环一次以上，纯化后获得细胞外囊泡-青蒿素装载物。

3、作为一些优化的实施方案，本发明超声的操作条件为：功率20-750w，频率10-40khz，超声探头直径0.1-5 mm，振幅5-60%，工作-间歇比为3-5min/1-4min，体系温度0-25℃，超声工作累计时间10-40min；冻融的操作条件为：冷冻温度-80℃~-10℃，冷冻时间为0.1-10h；解冻温度， 10-45℃，解冻时间10-150min。

4、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：功率20-400w。

5、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：频率25-35 khz。

6、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：超声探头直径0.1-1.0mm，更进一步优选为0.2-0.4mm。

7、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：振幅10-30%。

8、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：间隔时间为工作时间的1/2~2/3。

9、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：体系温度10-25℃。

10、作为一些更优化的实施方案，超声的操作条件为：超声工作累计时间10-40min，更进一步优选为累计时间15-30min。

11、作为一些更优化的实施方案，冻融的操作条件为：冷冻温度-80~-40℃，更进一步优选为-80~-60℃。

12、作为一些更优化的实施方案，冻融的操作条件为：冷冻时间0.5-10h，更进一步依次优选为0.5-8h、0.5-6h、0.5-4h、0.5-2h。

13、作为一些更优化的实施方案，冻融的操作条件为：解冻温度35-40℃。

14、作为一些更优化的实施方案，冻融的操作条件为：解冻时间0.5-10h，更进一步依次优选为0.5-8h、0.5-6h、0.5-4h、0.5-2h。

15、作为一些优化的实施方案，混合液中细胞外囊泡的蛋白终浓度为0.05-30 mg/ml，更进一步依次优选为0.05-20 mg/ml、0.05-10 mg/ml、0.05-5 mg/ml、0.1-1 mg/ml；青蒿素浓度相对于细胞外囊泡的蛋白终浓度过量，浓度优选为1.1-2倍，更优选为1.4-1.7倍。

16、作为一些优化的实施方案，保护剂可选自下述一种或多种：（1）小分子醇类渗透性保护剂，如甘油；（2）多糖基保护剂，如海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、透明质酸钠；（3）合成高分子聚合物，如聚丙烯酸钠；（4）纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠。

17、作为一些优化的实施方案，保护剂在混合液中的质量浓度为0.1-15%，优选为5~12%。

18、作为一些更优化的实施方案，保护剂采用质量浓度为4-6%的海藻酸钠和4-6%的甘油的复配。

19、第二方面，本发明还提供了一种细胞外囊泡-青蒿素装载物，具有300μg/ml以上的装载量，60%以上包封率；优选的，具有350μg/ml 以上的装载量，70%以上包封率。

20、作为一些优化的实施方案，本发明获得的细胞外囊泡-青蒿素装载物在300μg/ml的蛋白终浓度下，颗粒数大于1×1012，平均粒径不大于80nm；优选的，颗粒数大于1.4×1012，平均粒径不大于75nm。

21、作为一些优化的实施方案，本发明获得的细胞外囊泡-青蒿素装载物在参照gb/t27818-2011方法使用lc-ms/ms的18h透皮实验中，皮肤滞留率达到10%以上。

22、第三方面，本发明还提供了上述细胞外囊泡-青蒿素装载物在下述至少一个方面的应用：i. 单独或作为添加物之一在护肤品、化妆品中的应用；ii. 在制备治疗或改善痤疮的药物、护肤品或化妆品方面的应用。

23、与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

24、1、本发明采用了超声联合循环冻融的方式对青蒿素进行细胞外囊泡装载，二者联合克服了青蒿素的溶解问题、其与evs膜的接触和跨膜阻力问题、及装载效率低的问题。利用超声波的机械剪切力和循环冻融的方式使细胞外囊泡的膜产生瞬态小孔，增加膜的渗透性，促进目的分子的高效装载；同时超声的方式进一步提升青蒿素的分散性。此外，在保护剂的促进下使超声和冻融的循环交替维持了细胞外囊泡膜的相对稳定，大大提升了细胞外囊泡对青蒿素的装载效率及装载稳定性。进一步，超声的方式还可以弥补冻融可能带来的对evs的蛋白质和rna的团聚等负面影响，从而更好地维持evs的膜结构、活性分子的结构及生物学功能，更好地发挥稳定装载的效果。

25、2、本发明进一步研究了超声联合循环冻融的优化的操作条件，提出了上述方法中最适的操作条件及其达到的装载效率和护肤效果的协同优化指标，实现了经济性和效果的双重优化。

26、3、本发明获得的细胞外囊泡-青蒿素装载物具有较高的性能指标，在300μg/ml蛋白终浓度下，颗粒数大于1.4×1012，平均粒径不大于75nm，gb/t 27818-2011透皮实验中，皮肤滞留率达到10%以上。

27、4、本发明的细胞外囊泡-青蒿素装载物提供了一种良好的应用方向，可以用于护肤品、化妆品等发挥治疗或改善痤疮的功效。