与小麦抗旱相关的分子标记及其应用

本发明属于小麦遗传育种，具体涉及与小麦抗旱相关的分子标记及其应用。

背景技术：

1、干旱作为粮食作物减产及品质降低的主要原因之一，严重威胁粮食安全。开发干旱相关基因的分子功能标记极大方便抗旱育种。

2、植物的抗旱性是一个复杂的性状，涉及植株形态结构抗旱性、细胞生理生化抗旱性和分子水平抗旱性。评价植物抗旱性的指标很多，不能局限于单个指标来反映其抗旱性。必须从植物旱生能力及形态特征、解剖构造、生理生化特征、植物的生长产量状况等方面综合评价。因此，干旱基因研究最终的目的是将其运用于抗旱育种。其中分子功能标记的开发极大便利推进抗旱育种的进程。其中两大主要问题值得认真思考，其一基因来源新颖及遗传效应问题，其二多态性位点的开发代价。目前，有关干旱相关基因功能标记应用较为困难，主要原因在于基因新颖不足，遗传效应性差以及开发成本高等一系列原因。

3、蛋白质的翻译后修饰是其中一种重要的调节方式，包括蛋白激酶介导的磷酸化和蛋白磷酸酶介导的去磷酸化。pp2cs(protein phosphatases type 2c)是植物中最大的蛋白磷酸酶家族，可以在多个信号级联反应中发挥作用，在干旱和盐碱胁迫中，pp2cs通过依赖和不依赖aba两种方式发挥负调控作用。pp2c家族在各种植物中广泛分布。pp2c家族的序列具有一定的保守性，在拟南芥和水稻中，其外显子和内含子有相似的结构和长度。干旱是威胁植物生长和作物生产最严重的非生物胁迫之一。植物进化出了一系列复杂的信号通路来抵御干旱胁迫，aba在这一过程中起到了关键的作用。aba信号转导过程是最早报道的pp2cs参与的信号通路，也是研究最广泛的。在高等植物中，aba信号模块主要由3个部分组成，分别是aba受体pyr/pyl/rcars、a亚家族pp2c成员和snrk2s。pp2cs和snrk2s是此信号通路中的负调控因子和正调控因子。

技术实现思路

1、针对目前干旱基因所开发的分子功能标记类别较多，但存在检测周期长，效果差以及成本高等问题，本发明提供一种与小麦抗旱相关的分子标记。本发明首先挖掘到了干旱相关基因，基因多态性本身来源于自然群体，既便于分子功能标记的开发也利于筛选后的种质在遗传育种的直接利用。本发明直接针对多态性位点设计的分子功能标记具有快速、便捷、低成本和高通量的优点，便于抗旱种质筛选及育种利用。

2、本发明具体采用以下技术方案：

3、本发明首先鉴定了小麦抗旱基因tapp2c6，小麦tapp2c6基因的序列如seq id no:1所示。

4、本发明鉴定小麦tapp2c6基因功能的内容如下：

5、(1)tapp2c6基因克隆

6、提取小麦材料fielder幼苗阶段的叶片材料的rna，将rna反转录为cdna，以cdna为模板，采用pp2c6-orf-1f和pp2c6-orf-1r引物对进行pcr扩增，将扩增得到的tapp2c6基因片段进行回收后连接ta克隆载体，转化dh5a大肠杆菌感受态，再用pp2c6-orf-1f和pp2c6-orf-1r引物对进行菌落pcr检测，测序，获得tapp2c6基因的序列如seq id no:1所示。pp2c6-orf-1f和pp2c6-orf-1r引物序列如下：

7、pp2c6-orf-1f：catccgcccgtccgttc；

8、pp2c6-orf-1r：ttttcccagcccgaataaatgt。

9、(2)tapp2c6敲除小麦植株的获得

10、采用crispr/cas9技术编辑小麦tapp2c6基因。tapp2c6基因的靶序列为cagggtgatcaactggaac，ggg为pam序列。用于合成grna的上游引物为：aataatggtctcaagcgcagggtgatcaactggaac，下游引物为：gcagggtgatcaactggaacgttttagagctagaaatagc。

11、将tapp2c6特异靶向基因片段融合至crispr载体pbue411，测序正确的质粒转化至农杆菌eha105中。然后以小麦品种fielder为受体材料，采用农杆菌侵染愈伤组织的方法获得tapp2c6功能缺失突变体转基因植株。

12、(3)敲除tapp2c6转基因植株耐旱性评估

13、对敲除tapp2c6转基因植株和野生型对照在小麦拔节阶段进行轻度干旱、重度干旱、复水处理，观察其表型，测定其co2同化、蒸腾速率和水分利用效率(wue)，以评估其耐旱性。结果表明敲除tapp2c6转基因植株增强小麦抗旱性的功能。

14、对干旱处理后的敲除tapp2c6转基因植株的生理和光合指标、以及产量进行测定，结果显示，tapp2c6敲除转基因植株具有较低mda、h2o2含量及较高的cat含量，较浅的dab染色情况；且具有明显较高的净光合速率、较低的蒸腾速率及较高的水分利用效率，另外敲除tapp2c6转基因植株的具有较高的粒长、粒宽、单株产量及千粒重。

15、另一方面，本发明通过对小麦自然群体材料的tapp2c6基因启动子及基因区域克隆，获得了tapp2c6基因启动子和tapp2c6基因的多态性位点。其次，本发明基于不同单倍型启动子活性及基因表达分析结果，针对tapp2c6基因启动子的2个多态性位点分别设计特异分子功能标记，分子功能标记的扩增引物分别为：

16、pp2c6-1f：agagtaaaagaagtgcaacgtcgtg，

17、pp2c6-1r：agacagactgactgctctgcc；

18、pp2c6-2f：ggcagagcagtcagtctgtct，

19、pp2c6-2r：tgatgttccacacgagagtcca。

20、然后分别采用上述2对引物，以干旱胁迫后tapp2c6高表达(鲁麦1号，豫麦2号，石麦12)及低表达水平(晋麦54，晋麦47)的材料为模板进行pcr扩增，结果显示，上述2对引物的扩增产物的长度不同，即上述2对引物可将小麦抗旱材料和干旱敏感材料区分开，因此针对tapp2c6基因启动子的2个多态性位点的特异分子功能标记开发成功。

21、基于上述内容，可将pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r或含有pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r的试剂或试剂盒用于小麦抗旱性的检测中，或者应用于小麦分子标记辅助育种、小麦遗传图谱构建中。

22、本发明还提供一种鉴定小麦抗旱性的方法，包括：提取小麦材料的基因组dna，利用pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r或含有pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r的试剂或试剂盒对小麦材料的基因组dna进行pcr扩增，根据扩增产物长度确定小麦的抗旱性；其中，采用pp2c6-1f/pp2c6-1r扩增，扩增产物长度为348bp时，划分为干旱敏感型小麦，扩增产物长度为312bp时，划分为抗旱型小麦。采用pp2c6-2f/pp2c6-2r扩增，扩增产物长度为194bp时，划分为干旱敏感型小麦，扩增产物长度为391bp时，划分为抗旱型小麦。

23、本发明还提供一种小麦的育种方法，包括：提取小麦材料的基因组dna，利用pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r或含有pp2c6-1f/pp2c6-1r、pp2c6-2f/pp2c6-2r的试剂或试剂盒对小麦材料的基因组dna进行pcr扩增，根据扩增产物长度划分小麦的抗旱性；然后根据育种目标选择相应基因型的小麦材料作为亲本、选择后代、鉴定品种。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明基于挖掘到的干旱相关基因进行分子标记开发。由于该干旱基因的基因多态性本身来源于自然群体，既便于分子功能标记的开发也利于筛选后的种质在遗传育种的直接利用。本发明直接针对多态性位点设计分子功能标记具有快速、便捷、低成本和高通量的优点，便于抗旱种质筛选及育种利用。