一种改良型羰基还原酶及其工程菌的构建与应用的制作方法

本发明属于酶催化，具体涉及一种改良型羰基还原酶序列的优化、工程菌的构建及其在孟鲁司特钠中间体催化中的应用。

背景技术：

1、2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯是一种浅黄色固体结晶，cas no.:142569-69-5，分子式c28h24no3cl，分子量457.96，密度1.3±0.1g/cm3，logp＝7.04，易溶于二氯甲烷和四氢呋喃，其结构式为:

2、

3、2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯在医药工业领域有着广泛的用途，是孟鲁司特钠合成步骤中的重要中间体，几乎所有合成孟鲁司特钠的路线都要经过这个中间体。为了省去产生关键化合物的许多化学合成步骤，目前已有较多利用羰基还原酶将不同的羰基和醛底物向手性醇产物进行酶促转化的案例。这些应用可利用表达羰基还原酶的完整细胞来进行生物催化的羰基还原，或在多种羰基还原酶在完整细胞中的存在将不利地影响立体纯度和期望产物收率的情况下使用纯化的酶。对于体外应用，将再生酶例如葡萄糖脱氢酶(gdh)、甲酸脱氢酶等的辅助因子(nadh或nadph)与羰基还原酶共同使用。

4、cn 101889081 b中提供与天然存在的野生型羰基还原酶相比具有改进性质的人工改造的羰基还原酶。还提供了编码人工改造的羰基还原酶的多核苷酸、能够表达人工改造的羰基还原酶的宿主细胞和使用人工改造的羰基还原酶来合成2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的方法。催化底物浓度≥20g/l。

5、cn 104293850a中提出(e)-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯通过sigma公司的羰基还原酶催化得到2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯，催化体系含66％的甲苯，并添加辅酶与双氧水，收率可达91％-97％，催化底物浓度约33.3g/l。

6、综上，现有技术可以以(e)-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯为起始底物，由羰基还原酶和脱氢酶共同催化后生成2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。但存在着底物浓度低，生产成本高，需要添加辅酶等缺陷，因此生产工艺简单、绿色环保且高效2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的生产方法亟待开发。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种改良型羰基还原酶基因，并获得一种高效合成2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的工程菌，该菌可以以(e)-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯为起始底物，在不添加羰基还原酶的情况下，实现高效合成产物2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。

2、本发明的第一方面，提供一种改良型羰基还原酶，此酶同时具有羰基还原和异丙醇脱氢的功能。

3、本发明所述的改良型羰基还原酶来源于类布氏迟缓乳杆菌，其原始氨基酸序列如seq id no.1所示；原始核苷酸序列如seq id no.2所示。本发明所述改良型羰基还原酶氨基酸序列基于seq id no:1的参考序列至少90％相同的氨基酸序列。

4、本发明所述的羰基还原酶氨基酸序列为由seq id no.1所示氨基酸序列的第7位亲水性残基突变为碱性残基，和/或第76位亲水性残基突变为疏水性残基，和/或第100位酸性残基突变为碱性残基，和/或第195位疏水性残基突变为碱性残基，和/或第202位疏水性残基突变为疏水性残基。

5、本发明所述的羰基还原酶氨基酸序列为由seq id no.1所示氨基酸序列的第7位甘氨酸突变为组氨酸，和/或第76位苏氨酸突变为丙氨酸，和/或第100位谷氨酸突变为赖氨酸，和/或第195位亮氨酸突变为精氨酸，和/或第202位丙氨酸突变为赖氨酸。

6、本发明实施例所涉及的基因：

7、本发明所述的改良型羰基还原酶来源于类布氏迟缓乳杆菌，其原始氨基酸序列如seq id no.1所示；原始核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明所述kred变体g7h/t76a/e100k/l195r/a202w基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列。第7位甘氨酸突变为组氨酸、第76苏氨酸突变为丙氨酸、第100位谷氨酸突变为赖氨酸、第195位亮氨酸突变为精氨酸和第202位丙氨酸突变为赖氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶，该羰基还原酶氨基酸序列如序列表中seq id no.3所示，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

9、kred变体g7h/t76a/e100k/a202w是基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列将第7位甘氨酸突变为组氨酸、第76位苏氨酸突变为丙氨酸、第100位谷氨酸突变为赖氨酸和第202位丙氨酸突变为赖氨酸，该羰基还原酶氨基酸序列如序列表中seq id no.5所示，其核苷酸序列如seq id no.6所示。

10、kred变体g7h/l195r/a202w是基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列将7位甘氨酸突变为组氨酸、第195位亮氨酸突变为精氨酸和第202位丙氨酸突变为赖氨酸，其编码氨基酸序列如序列表seq id no.7所示,其核苷酸序列如seq idno.8所示。

11、kred变体t76a/l195r是基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列将第76位苏氨酸突变为丙氨酸和第195位亮氨酸突变为精氨酸，其编码氨基酸序列如序列表seq id no.9所示,其核苷酸序列如seq id no.10所示。

12、本发明所述kred变体g7k/t76a/e100k/l195r/a202w基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列。第7位甘氨酸突变为赖氨酸、第76苏氨酸突变为丙氨酸、第100位谷氨酸突变为赖氨酸、第195位亮氨酸突变为精氨酸和第202位丙氨酸突变为赖氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶，该羰基还原酶氨基酸序列如序列表中seq id no.11所示，其核苷酸序列如seq id no.12所示。

13、本发明所述kred变体g7k/t76a/e100r/l195r/a202w基于seq id no:1所示氨基酸序列的参考序列至少90％相同的氨基酸序列。第7位甘氨酸突变为组氨酸、第76苏氨酸突变为丙氨酸、第100位谷氨酸突变为赖氨酸、第195位亮氨酸突变为精氨酸和第202位丙氨酸突变为赖氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶，该羰基还原酶氨基酸序列如序列表中seq id no.13所示，其核苷酸序列如seq id no.14所示。

14、本发明所述的羰基还原酶氨基酸序列如seq id no.3所示；改造后核苷酸序列如seq id no.4所示。其中所述羰基还原酶能够将所述底物转化为具有至少99％的百分比立体异构过量的所述产物。

15、一种改良型羰基还原酶工程菌的构建方法，包括将羰基还原酶基因克隆到表达载体上构建得到重组表达质粒，然后将构建的表达质粒转入大肠宿主细胞中进行表达。表达载体和大肠宿主细胞不限型号，能异源表达即可。

16、本发明的第二方面，提供一种改良型羰基还原酶工程菌合成2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯的应用。

17、本发明中人工改造的羰基还原酶多肽与天然存在的野生型羰基还原酶相比，改造后的羰基还原酶多肽在将特定的酮底物转化为相应的醇产物中活性更好。以(e)-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯为起始底物，在不添加羰基还原酶的情况下，实现高效催化合成产物2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯。

18、发酵所用的培养基包括碳源、氮源、无机盐、消泡剂等；本发明不特别限定发酵培养基，只要有利于菌种生长即可，本领域技术人员可选择市售培养基或根据需要自行配置。

19、在一个实施方式中，发酵过程所用的培养基为蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、k2hpo417mm、kh2po472mm、甘油0.5％，消泡剂sag6300.001％。

20、发酵工艺是将表达羰基还原酶的重组工程菌接种逐级扩大培养，按发酵液体积1～10％的接种量，并接种至装有培养基的发酵罐中，37±0.5℃下培养，控制ph7.0±0.2，待od600达到80或以上时，加入诱导剂iptg诱导48h下罐，离心收集菌体。

21、在一些实施方案中，当用100g/l的底物和60g/l的菌体进行催化时，羰基还原酶能够在适宜的反应温度与ph下催化反应24h，将底物转化为产物，转化率达99％。催化体系包括甲苯、四氢呋喃、异丙醇和三乙醇胺，最后添加异丙醇补足催化体积。

22、优选地，所述的反应体系中甲苯含量10-30％，优选为15％。

23、优选地，所述的反应体系中四氢呋喃含量2-10％，优选为4％。

24、优选地，所述的反应体系中0.1m的三乙醇胺含量20-40％，优选为30％。

25、优选地，所述的反应温度为30-50℃，优选为45℃。

26、优选地，所述的反应体系中0.1m的三乙醇胺缓冲液ph为6.5-7.5，优选ph为6.9。

27、与现有技术相比，本发明取得了如下的有益效果：

28、本发明通过构建羰基还原酶的重组工程菌，实现了以(e)-2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯为底物一步高效合成2-[3-(s)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羟基丙基]苯甲酸甲酯，底物投料量约100g/l，转化率高达99％以上，本发明的酶同时具备羰基还原和醇脱氢的功能，方法工艺简单，底物转化率高，产物易于从反应液中分离纯化，工艺污染小，能耗低，易于放大生产。