一种生产靛蓝的菌株及其构建方法和应用

本发明涉及生物，特别涉及一种生产靛蓝的菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、靛蓝又名蓝靛、靛青，是一种广泛应用于食品、医药、印染和化妆品等行业的古老传统色素。目前，天然靛蓝色主要从木蓝、菘蓝、蓼蓝、马蓝、野青树等植物中提取，颜色鲜艳而耐久，安全性高。然而，伴随着人们对于蓝色素的需求越来越高，过程复杂且受限的工艺制约了植物提取的发展，逐渐被化学合成所替代。然而化学法会消耗昂贵催化剂，同时造成环境污染，不符合目前国家发展战略，因此迫切需要以绿色节能方式实现靛蓝的高效合成。

2、目前靛蓝的生物合成主要是通过添加前体氨基苯乙醇等化合物作为底物，利用醇脱氢酶以及黄素单加氧酶催化反应生成靛蓝。但传统生产靛蓝的工艺繁杂，导致过高的发酵成本投入，同时靛蓝产量低。而全细胞的生物合成局限于大肠杆菌、假单胞菌等模式菌株，靛蓝的产量同样不高。因此亟需一种能够降低生产成本、生成过程简单、靛蓝产量高的方法，以满足连续生产的需求。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种生产靛蓝的菌株及其构建方法和应用。

2、本发明提供了一种生产靛蓝的菌株的构建方法，包括如下步骤：

3、s1：体外扩增tnaa、fmo目的基因序列，插入载体，得到第一载体质粒；

4、s2：将s1所述第一载体质粒导入盐单胞菌中；

5、s3：在s2所述盐单胞菌中敲除了内源phea、pykf基因序列，在s2所述盐单胞菌基因组中插入trpd-trpc-trpb-trpa目的基因片段。

6、其中，tnaa的核苷酸序列如seq id no.47所示；fmo的核苷酸序列如seq id no.48所示；

7、trpd-trpc-trpb-trpa的核苷酸序列如seq id no.42所示；phea的核苷酸序列如seq id no.49所示；pykf的核苷酸序列如seq id no.50所示。

8、进一步的，步骤s2所述盐单胞菌为halomonas sp.ly01、halomonas sp.td01、halomonas sp.ly02、halomonas sp.ly03、halomonas campaniensis ly04中的任意一种。

9、本发明中使用的halomonas sp.ly01菌株已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：62635。菌株名称为halomonas sp.ly01，分类命名为halomonas sp.。

10、本申请中使用的halomonas sp.ly02菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：63381。菌株名称为halomonas sp.ly02，分类命名为halomonas sp.。

11、本申请中使用的halomonas sp.ly03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：63382。菌株名称为halomonas sp.ly03，分类命名为halomonas sp.。

12、本申请中使用的halomonas sp.ly04菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：63383。菌株名称为halomonas sp.ly04，分类命名为halomonas sp.。

13、进一步的，所述步骤s1的第一载体质粒中含有启动子，所述启动子为porin58。

14、进一步的，步骤s2盐单胞菌中还导入一个第二载体质粒，所述第二载体质粒包含gnd、pnta-pntb、nadk、ppnk中的任意一个目的基因序列；所述gnd、pnta-pntb、nadk、ppnk基因序列由体外扩增得到。

15、其中，gnd的核苷酸序列如seq id no.43所示；pnta-pntb的核苷酸序列如seq idno.44所示；nadk的核苷酸序列如seq id no.45所示；ppnk的核苷酸序列如seq id no.46所示。

16、本发明还提供一种生产靛蓝的菌株，由所述构建方法得到。

17、本发明还提供一种使用所述菌株生产靛蓝的方法，包括如下步骤：

18、(1)种子液的制备；

19、(2)摇瓶发酵培养。

20、进一步的，所述步骤(2)中发酵使用的发酵培养基中含有碳源，所述碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠中的一种或多种；葡萄糖酸钠成本低，同时能够提高靛蓝的产量。

21、进一步的，所述步骤(2)中发酵的温度为30～45℃，优选为36～38℃。

22、进一步的，所述步骤(2)中发酵的ph为7～10。

23、进一步的，所述步骤(2)中发酵的时间为10～100h，优选为36～48h。

24、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

25、1、本发明利用盐单胞菌生产靛蓝，靛蓝的产量高，在发酵装液量为20ml的摇瓶中，产量最高可达3.15g/l。

26、2、本发明生产靛蓝的方法简单、无需添加昂贵的催化剂，提高了工业化生产靛蓝的效果，从而降低生产成本。

技术特征：

1.一种生产靛蓝的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2所述盐单胞菌为halomonassp.ly01、halomonas sp.td01、halomonas sp.ly02、halomonas sp.ly03、halomonassp.ly04中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1所述第一载体质粒中含有启动子，所述启动子为porin58。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2所述盐单胞菌中还导入一个第二载体质粒，所述第二载体质粒包含gnd、pnta-pntb、nadk、ppnk中的任意一个目的基因序列；

5.一种生产靛蓝的菌株，其特征在于，由权利要求1～4任意一项所述的构建方法得到。

6.一种使用权利要求5所述的菌株生产靛蓝的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵使用的发酵培养基中含有碳源，所述碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵的温度为36～38℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵的ph为7～10。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵的时间为36～48h。

技术总结本发明提供了一种生产靛蓝的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增tnaA、fmo目的基因序列，插入载体，得到第一载体质粒；S2：将S1所述第一载体质粒导入盐单胞菌中；S3：在S2所述盐单胞菌中敲除内源pheA、pykF基因序列，在S2所述盐单胞菌基因组中插入trpD‑trpC‑trpB‑trpA目的基因片段。本发明利用盐单胞菌生产靛蓝，产量高，最高可达3.15g/L。利用重组菌生产靛蓝的方法简单、无需添加昂贵的催化剂，提高了工业化生产靛蓝的效果，从而降低生产成本，能够适用于工业大规模生产。技术研发人员：叶健文,林艺娜,刘凯旋受保护的技术使用者：华南理工大学技术研发日：技术公布日：2024/8/5