一种多功能免疫增强型重组疫苗及其构建方法

本发明涉及基因工程和生物医药，尤其涉及一种多功能免疫增强型重组疫苗及其构建方法。

背景技术：

1、疫苗作为人类防治传染病的有效手段，在帮助人类抵御疾病侵袭方面发挥了不可替代的关键作用。尽管种类繁多，但疫苗的作用机制大体相同，通过接种的方式，让接种者的固有免疫系统识别特定的病原微生物抗原，从而激活获得性免疫应答，使接种者产生对特定抗原的免疫反应及记忆能力，起到预防及治疗的作用。对于新型冠状病毒感染，多种核酸疫苗可以起到预防及治疗的作用。如何选择合适的递送载体是核酸疫苗目前面临的最大挑战。一方面要保持核酸分子的稳定，避免核酸酶的降解；另一方面，带负电的核酸分子需要合适的载体才能够实现高效递送。

2、重组疫苗作为亚单位疫苗的一种，包括重组蛋白疫苗以及重组多肽疫苗。具体地说，是将病原微生物具有免疫原性的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。相比于传统的使用完整病原体灭活疫苗，重组疫苗的特异性强，不容易引起免疫耐受。

3、上述疫苗所用的免疫原往往是天然免疫原。这类疫苗的风险之一是容易产生过敏等不良反应。此外，对于某些水溶性较低的抗原，重组疫苗的制备具有一定难度，鉴定抗原的特异性表位，表达长度较短的多肽疫苗成为更精准的疫苗制备方式。相比于重组蛋白疫苗，重组多肽疫苗具备更高的特异性。随着对细胞内抗原呈递过程的了解逐步加深，包括摄取、转运、溶酶体降解、mhc呈递、tcr识别、bcr识别等过程，目前已经开发出一些预测这些过程的算法，显著提高了表位预测的准确性。在确定hla亚型的前提下，通过syfpeithi、mhcpred、netmhc2.0以及iedb预测ctl、htl、b细胞表位；随后，对预测得到的结果进行免疫原性、疏水性、致敏性评估，采用vaxijen分析免疫原性，protparam分析疏水性，allertop分析致敏性，通过toxinpred预测毒性，整合所有结果筛选出候选短肽。目前，通过表位预测与实验验证相结合的方法已广泛应用于新型疫苗的设计开发中。

4、对于预测得到的表位重组疫苗来说，单纯进行免疫，造成的免疫应答反应较弱，往往限制了其广泛应用。因此提高表位疫苗的功能，开发出高效的促进方法具有十分重要的意义。通常预测表位可以分为两类，分别是t细胞表位与b细胞表位，其中t细胞表位在细胞免疫中发挥作用，b细胞表位在体液免疫中发挥作用。t细胞表位功能的促进，可以通过以下方式进行，在重组疫苗设计时需要添加不同功能的融合蛋白，例如toll样受体(toll-likereceptor，tlr)激动蛋白等，这类蛋白可以激活固有免疫细胞中的tlr，促进固有免疫细胞，如dc细胞、巨噬细胞等的活化；为了便于抗原呈递细胞对抗原的摄取处理与呈递，融合表达内吞受体的配体可以促进树突细胞对于抗原的呈递，例如dec-205等。

5、除此以外，b细胞表位在体液免疫中的作用能够通过整合强免疫原性非天然氨基酸(unnatural amino acid，uaa)得到提高。uaa是独立于哺乳动物细胞20种氨基酸之外的具有特殊侧链的氨基酸，在蛋白质合成的过程中掺入uaa可以赋予蛋白质新的功能以及调控蛋白的表达。uaa的整合通过生物正交系统实现，正交系统由能够转运uaa的trna和识别氨酰trna合成酶(aminoacyl trna synthetase，aars)组成，aars/trna不能与细胞内原始的氨基酸和trna有交叉功能，防止对细胞蛋白合成功能造成影响。通过aars/trna将uaa整合到目的蛋白琥珀密码子突变位点，从而实现位点特异性修饰。

6、对于长度较短的重组疫苗，体内半衰期较短，不利于免疫系统的充分激活，通常需要与长效分子融合表达，例如免疫球蛋白fc片段、人血清蛋白、人血清蛋白结合分子等。长效分子融合表达除了能够增加目的抗原的分子量，某些还能通过分子间作用力，如二硫键、形成多聚体，增强可溶性与递送效率，或是靶向结合细胞表面受体，缩短抗原在血浆中游离的时间，减少蛋白酶对抗原的降解，进一步提高重组疫苗的半衰期。

7、由于重组蛋白疫苗具有安全性高、稳定性强、成本较低等优点，已被广泛用于预防乙型病毒性肝炎(简称乙肝)、百日咳、白喉、破伤风(简称百白破)、流行性感冒(简称流感)等多种传染病。对于某些水溶性较低的抗原，重组疫苗的制备具有一定难度，鉴定抗原的特异性表位，表达长度较短的多肽疫苗成为更精准的疫苗制备方式。相比于重组蛋白疫苗，重组多肽疫苗具备更高的特异性。然而，现有技术生产的重组疫苗仍然具有特异性低、免疫原性差、半衰期短的问题。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多功能免疫增强型重组疫苗及其构建方法，旨在解决现有技术生产的疫苗特异性低、免疫原性差、半衰期短的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供一种多功能免疫增强型重组疫苗，所述重组疫苗为重组多肽疫苗或重组蛋白疫苗，所述重组疫苗包括目标抗原蛋白的一种或多种t细胞表位富集区和/或目标抗原蛋白的一种或多种b细胞表位富集区，以及固有免疫细胞激动蛋白序列及延长体内半衰期功能的长效分子蛋白序列。

4、进一步地，所述长效分子选自免疫球蛋白fc片段、人血清蛋白、人血清蛋白抗体、人血清蛋白结合分子abd中的任意一种；

5、优选地，所述长效分子通过柔性连接肽或者免疫球蛋白铰链区连接于所述重组疫苗的c端；

6、优选地，所述柔性连接肽的序列为ggggs；

7、优选地，所述免疫球蛋白fc片段包含或者不包含免疫球蛋白铰链区；

8、优选地，所述长效分子选自higg1 fc，所述higg1 fc包含或者不包含higg1铰链区；

9、优选地，所述higg1铰链区的k220进行k220a的突变；

10、优选地，所述higg1 fc的氨基酸序列如seq.id no.20和seq.id no.21所示。

11、进一步地，当重组疫苗包括目标抗原蛋白的t细胞表位富集区时，所述重组疫苗还包括固有免疫细胞激动蛋白序列；

12、优选地，所述固有免疫细胞激动蛋白序列与表位富集区之间通过刚性连接肽连接；

13、优选地，所述刚性连接肽的序列为eaaak；

14、优选地，所述固有免疫细胞激动蛋白选自tlr4激动蛋白、tlr1激动蛋白、tlr2激动蛋白、tlr5激动蛋白、tlr6激动蛋白中的任意一种；或者选自能激活tlr3、tlr7、tlr8、tlr9与tlr13的核酸及其类似物；

15、优选地，所述tlr4激动蛋白包括人纤连蛋白外结构域a、防御素、热休克蛋白中的任意一种；

16、当重组疫苗包括目标抗原蛋白的b细胞表位富集区时，所述重组疫苗还包括强免疫原性非天然氨基酸；

17、优选地，所述强免疫原性非天然氨基酸选自对硝基苯丙氨酸(pno2phe)、对磺酸基酪氨酸(so3tyr)、三硝基酪氨酸(3no2tyr)中的任意一种。

18、进一步地，所述重组疫苗包括目标抗原蛋白的1个t细胞表位富集区和1个目标抗原蛋白的b细胞表位富集区时，所述重组疫苗从n端至c端依次包括目标抗原蛋白的b细胞表位、刚性连接肽、固有免疫细胞激动蛋白序列、刚性连接肽、目标抗原蛋白的t细胞表位；

19、所述重组疫苗包括多个目标抗原蛋白的b细胞表位富集区时，所述b细胞表位富集区之间通过刚性连接肽连接；

20、优选地，所述刚性连接肽的序列为eaaak。

21、进一步地，所述重组疫苗的n端融合表达flag标签或者mbp标签。

22、进一步地，所述目标抗原蛋白为lmp2a时，所述lmp2a的t细胞表位富集区选自如seq.id no.1-5所示序列中的一种或多种，所述lmp2a的b细胞表位富集区选自如seq.idno.6所示序列；

23、所述目标抗原蛋白为新型冠状病毒刺突蛋白时，所述新型冠状病毒刺突蛋白的b细胞表位富集区选自如seq.id no.9-14所示序列中的一种或多种。

24、本发明第二方面提供一种靶向eb病毒抗原蛋白lmp2a的多功能重组疫苗，所述重组疫苗的序列自n端至c端为：lmp2a的b细胞表位富集区-刚性连接肽-heda-刚性连接肽-lmp2a的t细胞表位富集区-柔性连接肽或者免疫球蛋白铰链区-higg1 fc；所述lmp2a的t细胞表位富集区选自如seq.id no.1-5所示序列中的一种，所述lmp2a的b细胞表位富集区选自如seq.id no.6所示序列；

25、优选地，所述靶向eb病毒抗原蛋白lmp2a的多功能重组疫苗的氨基酸序列如seq.id no.7或seq.id no.8所示。

26、本发明第三方面提供一种靶向新型冠状病毒刺突蛋白的多功能重组疫苗，所述重组疫苗的序列自n端至c端顺次包括seq.id no.9、seq.id no.10、seq.id no.11、seq.idno.12、seq.id no.13、seq.id no.14所示序列，所述seq.id no.9-14所示序列之间通过刚性连接肽连接；

27、优选地，所述重组疫苗还包括在seq.id no.14所示序列的c端通过柔性连接肽或者免疫球蛋白铰链区与higg1 fc连接；

28、优选地，所述seq.id no.14所示序列的rrar位点突变为gsas位点；

29、优选地，所述重组疫苗还包括比对新型冠状病毒不同变种之间刺突蛋白的保守位点，选择其中暴露在外的酪氨酸或苯丙氨酸进行pno2phe的整合；

30、优选地，所述seq.id no.12所示序列的y20进行y20pno2phe的突变；

31、优选地，所述靶向新型冠状病毒刺突蛋白的多功能重组疫苗的氨基酸序列如seq.id no.15、seq.id no.16或seq.id no.17所示。

32、本发明第四方面提供上述重组疫苗的构建方法，包括如下步骤：

33、通过主要组织相容性复合体分布数据库分析特定人群的mhc亚型分布概率，筛选出符合预期分布概率的亚型作为预测亚型；

34、通过生物信息学工具分析所述预测亚型中目标抗原蛋白的t细胞表位以及b细胞表位，运用机器学习的方法分析所述目标抗原蛋白的潜在抗原表位，输出表位预测结果；

35、通过所述生物信息学工具对所述目标抗原蛋白的表位预测结果进行评分，并对所述表位预测结果进行免疫原性、致敏性以及毒性评估，筛选得到所述目标抗原蛋白的t细胞和b细胞表位，通过对其分布位置的分析，将位置重叠的t细胞表位或b细胞表位整合，筛选出单位长度上表位密度高的蛋白序列，得到表位富集区，即目标表位；

36、在所述目标表位融合表达延长体内半衰期的长效分子、引入固有免疫细胞激动蛋白和强免疫原性非天然氨基酸中的一种或两种，得到针对目标抗原蛋白的重组疫苗。

37、进一步地，所述构建方法的具体步骤包括：

38、通过mhc分布数据库分析特定人群的mhc亚型分布概率，筛选出高于10％分布概率的mhc-i与mhc-ii型主要组织相容性复合体作为预测亚型；

39、通过生物信息学工具分析所述预测亚型中目标抗原蛋白的t细胞表位以及b细胞表位，运用机器学习的方法，通过人工神经网络(artificialneuralnetwork，ann)以及稳定矩阵法分析(smm)所述目标抗原蛋白的潜在抗原表位，输出表位预测结果，其中，所述表位预测结果包括预测mhc亚型、表位在目标抗原蛋白中的起止位置、表位序列、得分以及排名；

40、通过所述生物信息学工具的评分系统，对所述目标抗原蛋白的表位预测结果进行评分，评分内容包括对t细胞表位与mhc亚型的结合强弱程度、对连续性b细胞表位以及空间结构临近的b细胞表位免疫原性评估，筛选出高得分表位，并对所述高得分表位进行免疫原性、致敏性以及毒性评估，筛选得到所述目标抗原蛋白的t细胞和b细胞表位，通过对其分布位置的分析，将位置重叠的t细胞表位或b细胞表位整合，筛选出单位长度上表位密度高的蛋白序列，得到表位富集区，即目标表位；

41、在所述目标表位融合表达延长体内半衰期的长效分子、引入固有免疫细胞激动蛋白和强免疫原性非天然氨基酸中的一种或两种，得到针对目标抗原蛋白的重组疫苗。

42、本发明的有益效果：

43、1、本发明提供的多功能免疫增强型重组疫苗选择表位富集区作为目标抗原，并针对不同性质的表位，采用不同的辅助免疫增强方法，具体地说，通过融合表达固有免疫细胞激动蛋白促进t细胞表位呈递，通过整合强免疫原性uaa提高b细胞表位的免疫原性，通过与长效分子的融合表达延长重组疫苗的体内半衰期。表位富集区即选取抗原蛋白的某一段序列，既保留了抗原蛋白原始的氨基酸序列，对于某些蛋白有助于表达及形成接近生理条件下的空间构象，同时也涵盖了多个预测的抗原表位。

44、本发明提供的通用的预测、筛选、重组抗原表位的方法，对于几乎所有蛋白重组疫苗具有普适性，同时提供了一种新型的蛋白重组方式，为新的疫苗开发提供了新思路和潜在可能性。

45、3、本发明关连接肽的选择，为了将b细胞表位突出，选择通过一个刚性连接肽eaaak将b细胞表位与固有免疫细胞激动蛋白序列连接，使其充分暴露。同时为了避免对fc分子多聚的干扰，在将t细胞表位与fc连接时采用柔性连接肽。

46、本发明实施例为克服现有的针对ebv疫苗的治疗效果不足的技术缺陷，提供一种全面的靶向eb病毒蛋白lmp2a的多功能重组疫苗设计、制备的方法，通过生物信息学工具，分析ebv抗原蛋白lmp2a的潜在抗原表位，选择表位富集区域，通过特定的组合方式以及排列方式与固有免疫tlr4激动蛋白heda融合表达，同时与长效分子higg1 fc融合表达，组成新型表位重组的lmp2a疫苗。同时，本发明开发的两种对于lmp2a阳性肿瘤细胞起到预防作用的多功能重组疫苗，为npc的肿瘤疫苗开发提供潜在可能。

47、本发明实施例提供的新型冠状病毒刺突蛋白(spike protein,s)的多功能重组疫苗，通过生物信息学软件预测s蛋白s1亚基潜在的b细胞抗原表位，将其用eaaak连接肽串联，并融合higg1 fc。在原核细胞中表达后，获得s蛋白的多功能重组疫苗。在此基础上，定点插入pno2phe，通过比对不同冠状病毒s蛋白s1亚基的序列，筛选出相对保守的苯丙氨酸、酪氨酸位点，并结合s蛋白的三维结构选取暴露于膜外的位点，最终筛选出突变位点y495。在原核表达系统中整合pno2phe，经亲和层析纯化，获得定点插入pno2phe的新型冠状病毒刺突蛋白的多功能重组疫苗。本发明提供的pno2phe整合的新型冠状病毒s蛋白的多功能重组疫苗，免疫小鼠后中和抗体效价得到提高，为新型冠状病毒疫苗的开发提供了新思路。