一种全氟辛酸半抗原及其制备方法与应用

本发明涉及食品安全免疫检测，尤其是指一种全氟辛酸半抗原及其制备方法与应用。

背景技术：

1、全氟烷基和多氟烷基化合物(pfas)是一类脂肪族有机氟化合物，近年来，由于其潜在的致癌性和致死性被大众所关注。全氟辛酸作为应用最为广泛的全氟羧酸化合物，由于其稳定的化学结构和高电负性以及氟原子半径小，是一类具有长半衰期和高积累潜力的环境持久性物质，同时该类物质具有较高的水溶性，能够迅速地在土壤介质中迁移扩散至地下水，从而导致较远的地下水污染。目前经过研究已经确认，全氟辛酸存在影响人体健康的风险，如癌症、不孕症、出生体重低和青春期延迟，其中特别是血脂异常这类影响脂质产生的疾病与全氟辛酸暴露的代谢相关性最高。国内外也意识到管控这类化学物质的重要性并且均发布了产品中全氟辛酸含量的规定，而针对全氟辛酸污染物治理的问题，如何检测水污染物、食物、食品包装材料以及饮用水中全氟辛酸的类型以及浓度成为一个重要的研究课题，因此建立一种监测人类赖以生存的水中以及临床样本中全氟辛酸的含量的快速检测方法具有重要意义。

2、目前，对全氟辛酸残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括气相色谱法、气相色谱-质谱串联法等。仪器法具有良好准确度和重现性的同时，由于对操作人员和设备要求较高，同时样品预处理流程较为繁琐且耗时长，不适合于随机采集的水样及其食物样本中全氟辛酸含量的快速监测，在一定程度上限制了其在基层的推广应用。相比而言基于抗原抗体间特异性反应的免疫分析法如酶联免疫检测法，基于抗原抗体特异性反应的免疫检测方法以其样品通量高、灵敏准确、操作简单、特异性好、适合样品筛查等优点，成为大型仪器法的互补方法，近年来发展迅速。目前需要建立一种简单、可靠的全氟辛酸快速检测方法来应对大量的样本检测任务具有重要应用价值，对于这类研究仍然是一个挑战，酶联免疫法是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为饮用水、食品以及食品包装中全氟辛酸检测提供了一种新的检测途径。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种全氟辛酸半抗原及其制备方法与应用。本发明通过将全氟辛酸完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了对全氟辛酸有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

2、本发明第一个目的在于提供一种全氟辛酸半抗原，所述全氟辛酸半抗原的结构式：

3、

4、本发明第二个目的在于提供所述的全氟辛酸半抗原的制备方法，包括以下步骤：

5、将化合物1与二氯亚砜混合反应，得到化合物2；

6、有机溶剂中，化合物2与化合物3混合，并在碱性条件下反应，得到化合物4；

7、将化合物4在三氟乙酸溶液中反应，得到所述全氟辛酸半抗原；

8、其中，化合物1的结构式：

9、

10、化合物2的结构式：

11、

12、化合物3的结构式：

13、化合物4的结构式：

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15、在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、dmf。

16、在本发明的一些实施例中，所述三氟乙酸溶液的溶剂为二氯甲烷；所述三氟乙酸溶液的浓度为50wt％，体积为40ml。

17、在本发明的一些实施例中，化合物4在三氟乙酸溶液中反应的条件：冰浴反应2-3小时。

18、在本发明的一些实施例中，碱性条件由加入碱性试剂得到，所述碱性试剂选自三乙胺。

19、在本发明中，所述全氟辛酸半抗原的具体制备方法如下：

20、将化合物1溶于二氯亚砜中，过夜回流，将二氯亚砜减压浓缩，得到粗产物化合物2.将上述得到的化合物2溶于的二氯甲烷中，冰浴下加入化合物3和三乙胺，之后恢复室温反应过夜，溶液减压浓缩，柱层析分离纯化得到化合物4，随后将得到的化合物4溶于二氯甲烷中，之后冰浴下加入50％的tfa/dcm溶液，冰浴下反应2-3小时，加入甲苯稀释，减压蒸馏，旋出多余的tfa，得到化合物5，即为全氟辛酸半抗原。

21、本发明第三个目的在于提供一种全氟辛酸完全抗原，由所述全氟辛酸半抗原制备所得。所述全氟辛酸完全抗原的制备方法如下：采用碳二亚胺法将全氟辛酸半抗原分别与载体蛋白bsa和ova偶联制备免疫原全氟辛酸-bsa和包被原全氟辛酸-ova，通过透析分离完全抗原与未偶联的半抗原；

22、本发明第四个目的在于提供一株分泌抗全氟辛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株knd，由所述全氟辛酸半抗原通过合成相应的完全抗原，免疫小鼠得到；已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2023年2月08日，保藏编号45478。

23、在本发明中，所述杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：

24、(1)、小鼠的免疫：将免疫原全氟辛酸-bsa与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫balb/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用全氟辛酸-bsa完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测血清效价和抑制；

25、(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(peg 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过hat培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-elisa)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得交瘤细胞株knd；

26、(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。

27、本发明第五个目的在于提供一种全氟辛酸单克隆抗体，由所述杂交瘤细胞株knd分泌所得。

28、本发明第六个目的在于提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的全氟辛酸单克隆抗体。

29、本发明第七个目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述的杂交瘤细胞株、所述的全氟辛酸单克隆抗体或所述的组合物中的一种或多种。

30、本发明第八个目的在于提供一种试纸条，所述试纸条含有所述的杂交瘤细胞株、所述的全氟辛酸单克隆抗体或所述的组合物中的一种或多种。

31、本发明第九个目的在于提供一种芯片，所述芯片含有所述的杂交瘤细胞株、所述的全氟辛酸单克隆抗体、所述的组合物中的一种或多种。

32、本发明第十个目的在于提供所述的杂交瘤细胞株、所述的全氟辛酸单克隆抗体、所述的组合物、所述的试剂盒、所述的试纸条或中所述芯片在检测全氟辛酸的应用。

33、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

34、本发明提供的交瘤细胞株knd分泌的单克隆抗体，对全氟辛酸具有较好的特异性和检测灵敏度(ic50值为1.13ug/ml)，可实现对饮用水、食品以及食品包装中全氟辛酸残留量的检测，为食品中全氟辛酸残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。

35、生物材料保藏:一株分泌抗全氟辛酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株knd，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为45478，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2023年2月8日。