一种自适应双光子全息光遗传学光刺激方法

本发明涉及光遗传学，尤其是涉及一种自适应双光子全息光遗传学光刺激方法。

背景技术：

1、近年来，瑞士脑计划利用分子层级的哺乳类脑部逆向工程建立电脑模拟脑，来“复制”人脑所有的活动，以及内部发生的各种反应；欧盟人脑计划的目标是建立最先进的研究基础设施，使科学和工业研究人员能够在神经科学、计算和脑科学相关的医学领域提高人们的知识；美国脑计划旨在加速新技术的开发和应用，生成大脑动态图片，展示个体脑细胞和复杂神经回路如何在时间和空间上相互作用；日本脑计划包括三个主题：绘制非人灵长类(狨猴)大脑的结构和功能图谱，发展创新神经技术，人类大脑的结构功能重建和临床研究。

2、在先前的研究中，已经得知了神经信号的产生与传导的本质是动作电位的产生和传导。其中，神经元动作电位产生的过程，实质上是钠离子通道打开，钠离子进入细胞内，使得膜内电位上升的过程；而神经元动作电位传导的过程，实质上是钙离子通道打开，大量钙离子进入突触，引起神经递质的释放的过程。通过向神经元细胞中引入钙离子指示剂，我们可以很方便地对动作电位的传导进行成像和监测，并以此来研究神经活动与行为之间存在的联系。

3、然而，在脑科学研究的过程中，为了更清晰地了解脑的微观结构(即神经元)是如何影响其宏观功能(即行为)的，不仅仅需要监测动作电位的传导，还需要一种可以人工的控制神经元动作电位产生的方法。最早人们使用电生理方法，用膜片钳直接对神经元电位进行控制，然而这种方法对细胞损伤大且可以同时操作的细胞数太少；随着转基因技术的发展，出现了化学遗传学这种通过改变细胞表面受体的方式，使其对某种特定的化学物质敏感从而控制动作电位的方法，但药物的作用往往会持续数个小时，这就使得这种方式的时间精度非常差；而后随着几种对特定波长的激光敏感的光敏蛋白被发现并在动物的神经元细胞中被成功表达，光遗传学随之诞生。

4、光遗传学技术可以帮助我们：

5、①确定与行为对应的神经网络。传统的钙离子成像技术可被动地记录到与行为相关的神经活动，而光遗传技术则可通过主动控制神经元活动的方式诱发出相应的行为，因而可以更确凿地理解与行为相关的神经网络。目前已经进行的探讨包括恐惧情绪、学习记忆等方面。

6、②研究特定神经元及神经网络的功能。由于光遗传技术的细胞特异性，我们可以通过控制单一种类神经细胞在整体动物中的活动来了解这一类神经细胞的特异性功能。同时，我们还可以通过监测周围细胞的活动来了解神经回路的工作机制。

7、因此光遗传学技术如今已经成为脑科学研究中最重要的技术之一。

8、现有的闭环光遗传学技术的主要流程为，先进行一次钙离子成像，对所得图像进行图像增强、神经元分割后得到神经元分布情况，再手动选择目标神经元。

9、之后在同一位置进行光刺激实验，并同时进行钙离子成像，通过成像结果判断目标神经元是否激发，没有激发则增强刺激点功率直到所有目标神经元都达到激发状态。

10、该技术的主要缺点在于：这一技术中，对所有目标神经元的光刺激强度始终保持了一致，没有对每一个神经元进行精细化的调整，而且由盖师贝格-撒克斯通算法得到的全息图在投影时的激发光功率分布也并不是完全均匀的，刺激光功率在各个目标点上的分布具有一定随机性；而在实际的生物体中，不同的神经元所需的激发光强度其实是不一样的，保持同强度的刺激既是对激光光源功率的浪费，也会造成某些激发强度阈值低的神经元过早的失活；并且即使成功激活了所有目标神经元，也无法保证它们的活跃程度(即钙信号强度一致)而这对于实验中的数据分析是不利的。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在对所有目标神经元的光刺激强度始终保持了一致，造成激光光源功率的浪费，也会使得部分神经元过早的失活，无法保证目标神经元的活跃程度一致的缺陷而提供一种自适应双光子全息光遗传学光刺激方法。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种自适应双光子全息光遗传学光刺激方法，包括以下步骤：

4、s1：采用成像光路和刺激光路对待刺激样品进行成像测试，根据两个光路的成像结果获取刺激光路的校正参数，对刺激光路进行校正；

5、s2：根据成像光路的成像结果获取神经元分布，选取感兴趣的神经元作为激发目标，并生成初始的全息图；

6、s3：采用成像光路和校正后的刺激光路对待刺激样品进行交替地成像和刺激，采用钙离子分析算法对各个神经元的钙信号进行分析，判断是否已达到激发目标，若未达到，则按照预设的第一步长升高相应点处的光刺激功率；若达到，则降低相应的点处的光刺激功率，从而调整全息图各点处的光刺激功率；

7、s4：采用调整后的全息图迭代执行步骤s3，直至达到预设的迭代截止条件，获取最终的全息图及其各点处的光刺激功率。

8、进一步地，所述成像光路包括依次分布的第一透镜、第二透镜、空间光调制器、第三透镜、中心相面和第四透镜；

9、所述第一透镜和第二透镜构成一组扩束镜，用于将输入第一透镜的光斑面积放大，以覆盖空间光调制器的整个表面；

10、所述空间光调制器用于对入射的光斑按照输入的全息图进行调制；

11、所述第三透镜用于对空间光调制器调制后的光聚焦到中心相面处；

12、所述中心相面用于显示待投射的图案；

13、所述第四透镜用于将中心相面显示的待投射的图案缩小到适应扫描系统的光学元件的直径。

14、进一步地，所述中心相面安装有中心镀银的平面镜，用于屏蔽空间光调制器调制后光的中心亮点。

15、进一步地，采用盖师贝格-撒克斯通算法计算成像光路所需的全息图。

16、进一步地，设输入幅值分布和相位分布分别为ρ1(x1,y1)和φ1(x1,y1)，输入波形为e1(x1,y1)，目标的幅值分布和相位分布分别为ρ2(x2,y2)和φ2(x2,y2)，出射波形为e2(x2,y2)，则所述盖师贝格-撒克斯通算法包括以下步骤：

17、s201：由已知的输入幅度分布ρ1(x1,y1)和随机的初始相位，计算出初始输入波形，该初始输入波形的计算表达式为：

18、

19、式中，为初始输入波形，为随机的初始相位；

20、s202：对初始输入波形进行傅里叶变换后得到像平面波形，并分离得到生成的幅值分布与相位图，对应的计算表达式为：

21、

22、式中，为像平面波形，为对初始输入波形进行傅里叶变换，为生成的幅值分布，为生成的相位图；

23、s203：将生成的相位图与目标的幅值分布ρ2(x2,y2)相叠加得到期望的目标波形，该期望的目标波形的计算表达式为：

24、

25、式中，为期望的目标波形；

26、s204：对期望的目标波形进行傅里叶逆变换，得到期望的源波形，并分离得到期望的源波形幅值分布和相位分布，对应的计算表达式为：

27、

28、式中，为期望的源波形，为对期望的目标波形进行傅里叶逆变换，为期望的源波形幅值分布，为期望的源波形相位分布；

29、s205：将得到的期望的源波形相位分布与已知的输入幅度分布ρ1(x1,y1)叠加，得到新的输入波形；

30、s206：重复步骤s201-s205，直至生成的幅值分布与目标的幅值分布之间的差值低于预设的阈值，根据最终获取的期望的源波形相位分布，构建全息图。

31、进一步地，步骤s206中，根据最终获取的期望的源波形相位分布，获取对应z平面的全息相位图，通过计算不同z平面的全息相位图，并进行叠加和分离出相位后，得到对应的全息图。

32、进一步地，对刺激光路进行校正的过程包括位置偏移校正和径向畸变校正，通过成像测试过程获取多组目标全息图案和实际刺激图案的数据组，从而对偏移校正和径向畸变校正对应的公式进行校正参数的拟合求取，采用获取的位置偏移校正和径向畸变校正公式进行刺激光路的校正。

33、进一步地，所述位置偏移校正的校正公式为：

34、

35、式中，l1,l2,l3表示三个方向上的拉伸，σ1,σ2,σ3表示三个方向上的旋转，x0,y0,x0表示三个轴中心的偏移，x1,y1,x1为中心点位置，x2,y2,x2为校正后的中心点位置。

36、进一步地，所述径向畸变校正的校正公式为：

37、

38、

39、式中，是样品上图像中的某点像素坐标；u,v是矫正后图像中对应点的像素坐标，即slm对应的全息图案中相应点的坐标，u0,v0是矫正后图像的中心点像素坐标，u1,v1是样品上图像中的某点像素坐标，x,y是矫正后图像点坐标在横纵方向到中心点的像素数也就是图像坐标。

40、进一步地，步骤s3，对于达到激发目标的点的刺激功率更新表达式为：

41、

42、式中，δp为更新后的刺激功率，为该神经元的钙信号强度，为该神经元的目标钙信号强度，为该神经元的当前钙信号强度，k为钙信号强度与刺激功率间的换算常数。

43、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

44、(1)本发明使用了钙信号在线分析的方法，可以在成像过程中实时地进行图像增强、神经元分割、钙信号提取分析等操作，相对于传统技术，操作更为简便；

45、同时，自适应控制目标为各个目标神经元的钙信号强度，保证了每个目标神经元都被激发的同时，也将每个神经元上的刺激光强度控制到了最小可用值，在最大程度上利用了光刺激光源的功率，还保证了每个目标神经元的活跃程度也相同，同时最大程度上减少了光遗传学实验对脑组织的损伤，实现对多个神经元的高速精细化调控，由此可以为神经环路示踪、脑相关疾病的治疗等提供新的工具和方法。

46、(2)本发明可以自适应地完成钙信号的图像增强、神经元分割、钙信号提取分析等操作，并在此基础上进行闭环光遗传学实验。

47、(3)对各种要求刺激强度不同的神经元，本发明能够进行多神经元同时刺激并自适应地调控神经元兴奋程度的能力。