一种赤霉素GA4重结晶纯化的方法与流程

本发明涉及植物生长调节剂生产提取领域，具体涉及一种赤霉素ga4重结晶纯化的方法，该方法适用于赤霉素ga4的纯化。

背景技术：

1、植物生长调节剂(p l ant growth regu l ators)是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质。在农业生产上经常用于有效调节作物的生长发育过程，达到稳产增产、改善品质、增强作物抗逆性等目的。而赤霉素(gibbere l l i ns，gas)是目前使用最广泛的植物调节剂之一，目前已发现的赤霉素共有136种，总称为赤霉素类(gas)，但赤霉素种类繁多，目前市场应用开发比较成熟并进行规模化工业生产的赤霉素主要有：赤霉素ga3、赤霉素ga4、赤霉素ga7。其中市面上用的最广泛的是赤霉素ga3，近年来，由于赤霉素ga3生理活性过强、作用效果单一等局限性，从而限制了其在某些方面的应用；赤霉素ga7虽然生理活性稍低，但其对核果类植物的疏花和疏果，改善果实品质具有较好的效果，近年来也得到了较广泛的生产与应用。目前针对赤霉素ga7的重结晶纯化方法主要有cn117164540a，该方法是将赤霉素ga7粗品使用乙醇溶解后，经过滤得到赤霉素ga7溶解液，ga7溶解液经过活性炭脱色后，再进行过滤，得到赤霉素ga7脱色液，赤霉素ga7脱色液使用盐酸调节ph至1.4～1.7后，缓慢加入去离子水至赤霉素ga7精粉不再析出，静置后进行过滤、干燥而得到纯化后的赤霉素ga7精粉，其赤霉素ga7含量≥90％以上。重结晶纯化的收率达到85％以上。

2、赤霉素ga4不同于赤霉素ga7，赤霉素ga4因其较高的生理活性以及独特的作用效果成为了该领域的研究热点，尤其在果蔬保鲜，以及花卉保鲜方面，赤霉素ga4的效果最为明显。目前对于赤霉素ga4生产工艺的主要专利技术主要有cn114958626a-一株产赤霉素ga4菌株及其应用，但针对赤霉素ga4的重结晶纯化工艺方法，尚未见到相关专利文献报导。

3、目前市场上商用的赤霉素ga4几乎都是用微生物发酵所得，随着发酵水平的不断提升，发酵的周期通常也会变得更长，这会带来大量的蛋白质、糖类以及其他的有机杂质，这些杂质在提取过程中很难去掉，造成了目前赤霉素ga4的含量不高，产品质量不好等问题。目前赤霉素ga4的提取主要使用的工艺有两种，一种为：发酵液经过板框处理、膜浓缩、萃取等步骤以后，进行浓缩，使用正丁醇为稀释剂，n,n-二甲基苄胺为沉淀剂，再调节ph析出赤霉素ga4晶体。另一种使用的是减压浓缩直接结晶法。这两种方法提取的赤霉素ga4纯度在75％-92％之间，其中还含有大量的杂质导致提取出来的赤霉素ga4颜色也发暗，略带黄色，这与市场用户所期待的能提供更高更好的赤霉素ga4产品的质量要求，越来越不相符，同时，随着发酵水平的提升，发酵液杂质含量越来越高，使用这两种方法提取得到的赤霉素ga4的含量只会越来越低。另外，我们在研究过程中，试图沿用cn117164540a一种赤霉素ga7重结晶纯化的方法，来进行赤霉素ga4重结晶纯化工作，但经多次试验后发现并不成功，采用该方法纯化后的赤霉素ga4含量只有86％左右，纯化收率只有75％左右。因此针对赤霉素ga4分子结构差异性和粗品中杂质含量大等特性，开发一种赤霉素ga4重结晶纯化的方法十分有必要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是：针对现有赤霉素提取技术中所得到的赤霉素ga4含量太低，无法达到用户要求和出口产品质量标准，而提供一种新的赤霉素ga4重结晶纯化的方法，该纯化方法操作简单，易于实施，且安全环保。

2、本发明通过以下技术方案来实现发明目的。

3、s1、赤霉素ga4粗品的溶解：赤霉素ga4粗品用乙醇或丙酮进行溶解；

4、s2、杂质吸附：使用一定量的活性炭对ga4溶解液进行吸附处理；该活性炭能吸附ga4粗品中所含的一些大分子蛋白、有机小分子等杂质，并对ga4粗品中所含的色素能够吸附而达到除杂的目的。

5、s3、过滤：将吸附处理后的赤霉素ga4粗品溶解液进行过滤，收集滤液；

6、s4、结晶：在吸附处理后的ga4滤液中加入一定量的去离子水，静置待滤液完全结晶；

7、s5、过滤与干燥：ga4滤液结晶完全后，进行过滤操作，得到ga4精粉湿品；对湿品进行干燥得到ga4精粉，称重并测其含量，计算重结晶纯化收率；

8、s6、溶剂回收：过滤后的母液进行溶剂回收，回收至一定体积后，取样检测余下母液的效价。经溶剂回收后余下的母液中除含微量的ga4及微量的可溶杂质外，其余全部为去离子水，可直接排至环保处理，回收后的溶剂可套用至步骤s1中的粗品溶解过程中。

9、进一步地，步骤s1中所述的乙醇或丙酮与赤霉素ga4的体积和质量比为4-6:1；更优选为5-6：1。

10、进一步地，步骤s2中所述的活性炭用量为溶解液体积的0.15％-0.25％(w/v)；搅拌时间为10min-20min；静置时间为20min-30min。更优选为：活性炭用量为0.25％；搅拌时间为20min；静置时间为30min。

11、进一步地，步骤s3中所述的滤液效价为120000-250000ug/ml。

12、进一步地，步骤s4中所述的结晶时加入去离子水的体积与料液体积的比例为3-5：1；结晶时间为2-4个小时。更优选为：加入去离子水的体积与料液体积的比例为4：1；结晶时间为3个小时。

13、进一步地，步骤s5中所述的干燥为真空干燥；温度控制在60-80℃；真空度控制在-0.07至-0.10mpa。

14、重结晶纯化收率计算公式为

15、其中：y代表收率；m表示重结晶后精粉质量；w％代表重结晶后精粉含量；m代表粗品质量；w％代表粗品含量。

16、进一步地，步骤s6中所述的回收溶剂一般使用真空浓缩，真空浓缩温度控制在55-65℃；真空度控制在-0.08至-0.10mpa；回收溶剂时间为3-5个小时。

17、上述的一种赤霉素ga4重结晶纯化的方法，与cn117164540a(一种赤霉素ga7的重结晶纯化方法)相比，发现：该方法看似与cn117164540a的步骤大致相同，仅是在用活性炭进行杂质吸附后，关键是少了用盐酸调节ph至1.4～1.7这一步骤。

18、为什么在进行赤霉素ga7的重结晶纯化过程中，在活性炭进行脱色后，要用盐酸调节ph至1.4～1.7，而本发明在赤霉素ga4重结晶纯化过程中，在活性炭进行杂质吸附后，不能用盐酸调节ph至1.4～1.7呢？这是由于ga4与ga7分子结构差异性所决定，以及所要去除的杂质性质不同所造成的。

19、其中：ga3的分子式为c19h22o6，在分子结构式为：

20、

21、而ga4、ga7的结构式与分子式，分别列举如下：

22、

23、有效成份：赤霉酸ga4、赤霉酸ga7

24、分子式：ga4为c19h24o5；ga7为c19h22o5；，

25、分子式的差异：ga4比ga7多了2个氢原子；

26、分子结构上的差异：ga4比ga7少了一个双键。

27、相对分子质量：ga4为332.39；ga7为330.38(1998年国际相对原子质量)

28、熔点:ga4为222℃；ga7为202℃

29、本发明的关键：之所以少了用盐酸调节ph至1.4～1.7这一步骤，首先是由于ga4与ga7在分子式与分子结构上的差异所决定的。ga4与ga7对比在分子结构上少了一个双键，由于ga7的双键可以与羟基形成一个共轭结构，因此ga7的耐酸性能更好，将ph调节至1.4～1.7，对ga7的分子稳定性与生物活性基本无影响。而ga4的耐酸性能相对于ga7较差，若将ph调节至1.4～1.7，赤霉素ga4在该条件下会发生部分降解，导致收率偏低。

30、本发明的关键：之所以少了用盐酸调节ph至1.4～1.7这一步骤，其次是由于ga4和ga7所要去除的杂质显著不同而决定的。ga7重结晶所需要去除的杂质，是因为粗品ga7中所含的主要杂质为ga7的同分异构体，在液相色谱图中会出一个较大的峰，而其他的杂质相对较少(见图4)，该同分异构体与ga7性质相似，传统的重结晶方式难以去除，因此需要调节ph至1.4～1.7将同分异构体破坏掉后再进行重结晶。对于粗品ga4中所含的主要杂质为一些大分子蛋白、有机小分子杂质和色素，并不含ga4的同分异构体(见图2)，其粗品ga4的重结晶只需去除这些杂质即可，所以ga4与ga7所采用的重结晶纯化工艺并不相同，其中不用盐酸调节ph至1.4～1.7，是本发明为了实现有效提高重结晶纯化后精粉的ga4含量、有效提高重结晶纯化收率的双重目的而采取的关键措施，该步骤的删除是本发明人通过长期的艰辛实验而摸索得来的，属于非显而易见。

31、有益效果：

32、(1)采用本发明所述的方法，对赤霉素ga4粗品进行重结晶纯化，得到的赤霉素ga4精粉含量高。采用本发明得到的赤霉素ga4精粉含量均可达到96％以上，最高可达98.3％，完全超过了ga4含量≥90％的出口标准。如果沿用cn117164540a(一种赤霉素ga7重结晶纯化的方法)来进行赤霉素ga4重结晶纯化工作，纯化后的赤霉素ga4含量只有86％左右。

33、(2)采用本发明所述的方法，对赤霉素ga4粗品进行重结晶纯化，重结晶纯化收率高。采用本发明，其重结晶纯化收率可达到92％以上，最高可达97.46％。如果沿用cn117164540a(一种赤霉素ga7重结晶纯化的方法)来进行赤霉素ga4重结晶纯化工作，重结晶纯化收率只有75％左右。

34、(3)采用本发明所述的方法，对赤霉素ga4粗品进行重结晶纯化，工艺流程简单，既安全又环保，操作简便、易于实施，处理量大，非常适合工业化生产。由于本发明所述的一种赤霉素ga4重结晶纯化的方法，其中的s1步骤中使用的是用乙醇或者丙酮溶解赤霉素ga4粗品，该乙醇或者丙酮可完全回收并重复使用；而s4结晶步骤中只需加入一定量的去离子水静置，就可使滤液中的ga4成分完全结晶，不需使用其他有机溶剂；s6步骤中经溶剂回收后余下的母液中除含微量的ga4及微量的可溶杂质外，基本全是水，无废物产生，可直接排至环保处理，既安全又环保。