用于检测临床样品中小分子的免洗发光试剂及其使用方法与流程

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种用于检测临床样品中小分子的免洗发光试剂及其使用方法。

背景技术：

1、样品中待测物的定量分析是医学领域常用的方法。待测物包括蛋白质，核酸，脂类及小分子成分。由于待测物的含量有时会很低。目前很多方法都以广泛应用在临床检测中，如：酶联免疫分析、放射免疫分析等等。然而酶联免疫分析存在一定的局限性，其对于但检测物质的抗原性要求较高，对于复杂样品效果不太理想，此外其灵敏度和动态范围有限，不适于低浓度物质的检测。放射免疫分析也存在着放射性防护和同位素污染的问题。免疫荧光和发光目前也进入临床分析领域。免疫发光目前是相对比较灵敏的分析方法，也是目前比较有希望检测微量水平待测物的技术。免疫发光分析的方法随然可以提高检测的灵敏度，但是，对于小分子待测物不易得到一对可以做免疫分析的抗体来完成反应，中间的多次清洗步骤使得整个过程繁琐。延长了操作时间和提高了对仪器或人工的要求。因此如果能够提供一项免洗的免疫发光技术，则会大大缩短分析的时间和提高分析的自动化。我们曾经发明了一种利用酶活性复活的免洗技术，该技术是免洗的特别针对小分子的检测非常有意义。克服了繁琐的清洗步骤，有利于检测的自动化。该技术对于利用荧光检测可以适合，但对于发光试剂不很理想，主要是干扰物的影响，比如样品中的三磷酸腺苷和焦磷酸干扰几乎无法克服。

技术实现思路

1、本发明针对目前的问题进一步改进，克服了干扰物的问题，清洗步骤达到减少样本中干扰物质如三磷酸腺苷和焦磷酸，创造出了一种对小分子的抗干扰、免洗的用于检测临床样品中小分子的免洗发光试剂及其使用方法。

2、本发明的技术方案：

3、一种用于检测临床样品中小分子的免洗发光试剂，所述试剂包括试剂1、试剂2和试剂3；

4、试剂1包括抗待测小分子的抗体、抗干扰物水解酶、荧光素、焦磷酸酶和缓冲体系；

5、试剂2包括焦磷酸酶抑制剂、5'-磷酸硫酸腺苷、多聚酶的底物、引物/模板复合物、三磷酸脱氧核苷酸和缓冲体系；

6、试剂3包括三磷酸腺苷硫酸化酶、多聚酶、牛血清蛋白和缓冲体系。

7、本发明是利用酶活性的竞争性干扰和恢复方法来检测待测物含量的原理(1)发明一项由三个试剂组成的分析系统用来检测样品中待测成分。

8、反应步骤1.

9、总抗体+含待测物样品→抗体-待测物+游离抗体+其他

10、反应步骤2.

11、游离抗体+游离待测物标记引物/模板→抗体-待测物标记引物/模板+游离待测物标记引物/模板

12、反应步骤3.

13、游离待测物标记引物/模板+dna多聚酶→双链dna+焦磷酸

14、反应步骤4.

15、ppi+5'-磷酸硫酸腺苷→atp

16、反应步骤5.

17、atp+荧光素+荧光素酶→单磷酸腺苷+ppi+光子

18、从反应的过程可以看出，样品中的三磷酸腺苷和焦磷酸都可以对结果产生影响，必须加以清除。在某些实施案中，包含清除样品干扰物的方法。由于临床样品中常会有干扰物质的存在，如比atp存在于正常血清中，atp也是本方法的反应中间物质，其存在可以直接影响结果的准确性。本发明提出一种消除样品中atp的方法。清除atp后仍然会产生新的干扰物质，如焦磷酸。焦磷酸仍然属于检测时的中间检测物所以同时需要进一步除去产生的焦磷酸带来的影响。

19、消除atp：atp+荧光素+荧光素酶→amp+ppi

20、本发明消除样品中的atp干扰物是通过采用atp氧化酶将atp氧化变成amp和焦磷酸。从而消除atp的影响。焦磷酸可能来自样品，试剂成分降解和上面的atp。本发明的实施案中采用的抗焦磷酸的抗干扰剂为焦磷酸水解酶。焦磷酸水解酶水解的方法除去焦磷酸。水解后的焦磷酸转化为单磷酸，不再对检测造成影响。

21、消除焦磷酸：ppi+焦磷酸酶→2x pi

22、在某些实施案中，本技术实现要素：涉及到如和消除抗干扰物对检测的影响。比如，焦磷酸酶会降解多聚核酸酶反应时生成的焦磷酸。反应生成的焦磷酸是我们测量时的检测成分之一。如果试剂中有焦磷酸酶的存在，就会大大消除反应产生的信号。所以焦磷酸酶必须在检测反应前除去或使焦磷酸酶失去活性，否则影响接下来的检测。本发明采用的是无机物氟化钠，焦磷酸酶的小分子抑制剂来失活焦磷酸酶。

23、失活焦磷酸酶：焦磷酸酶(活性)+naf→焦磷酸酶-f(失活)

24、本发明涉及包括选择待测物和待测物结合物，如抗体，选择待测物的类似物，选择核酸底物并与待测物类似物交联，选择核苷酸多聚酶组成试剂的基本成分。待测物的结合物与核苷酸上面交联的待测物结合后将抑制核酸酶的活性，从而得不到核酸酶的产物。分析样品中的待测物可以与核酸分子上的类似物竞争结合它们的结合物(如抗体)，从而使核酸酶结合核酸分子并生成反应产物，如新的核酸，核苷酸，焦磷酸等。根据核酸酶产物的含量可以推算出样品中的待测物的含量。

25、优选的，所述的试剂中抗干扰物水解酶包括荧光素酶；

26、抗干扰物酶抑制剂包括焦磷酸酶抑制剂。

27、优选的，试剂1中抗待测小分子的抗体的浓度0-100ug/ml；

28、抗干扰物水解酶的浓度为6ug/ml～60ug/ml；

29、荧光素的浓度为50ug/ml～500ug/ml；

30、焦磷酸酶的浓度为0.02u/ml～0.1u/ml。

31、优选的，试剂2中抗干扰物酶抑制剂的浓度为20mm～60mm；

32、5'-磷酸硫酸腺苷的浓度为3ug/ml～20ug/ml；

33、引物/模板复合物的浓度为10nm～50nm；

34、三磷酸脱氧核苷酸的浓度为2um～10um。

35、优选的，试剂3中三磷酸腺苷硫酸化酶的浓度为1u/ml～10u/ml；

36、多聚酶的浓度为0.02u/ml～0.1u/ml；

37、牛血清蛋白的质量含量为0.1％～0.3％。

38、优选的，试剂1、试剂2和试剂3所述的缓冲体系包括nacl、na3n、mgcl2和tri-hcl。

39、优选的，所述的缓冲体系中

40、nacl的浓度为25mm；

41、na3n的质量含量为0.05％；

42、mgcl2的浓度为20mm；

43、tri-hcl的浓度为50mm。

44、优选的，所述的缓冲体系的ph值为7～8。

45、一种用于检测临床样品中小分子的免洗发光试剂使用方法，s1将待测样本与试剂1混合后孵育，当试剂1和不同浓度待测物的样品混合后，结合待测物的抗体首先和样品中的待测物中含有的待测物结合。待测物同时中和掉相应量的待测物结合抗体，对接下来的抗体和dna引物/模板上交联的待测物类似物的结合起到阻断作用。试剂第一部分的另外一组成分是样品中干扰物的清除剂。清除剂包括荧光素和荧光素酶。样品中的主要干扰成分为三磷酸腺苷。atp有荧光素存在时可以在荧光素酶的作用下生成单磷酸腺苷，焦磷酸和氧化荧光素。从而消除三磷酸腺苷对检测产生的假阳性影响。由于样品中还可能含有另一种干扰物质焦磷酸.焦磷酸也可以来自清除三磷酸腺苷时产生。实施例中的第一组分中还加入了焦磷酸的清除剂，焦磷酸酶。焦磷酸在焦磷酸酶的作用下会被水解成为磷酸单体,从而消除接下来对发光造成的假阳性影响。

46、s2将s1孵化后的待测样本与试剂2混合后孵育，试剂1和试剂2样品化合物混合以后，试剂1中与样品中待测物反应后剩余的抗待测物抗体会和试剂2中的dna引物/模板上面交联的待测物类似物结合，从而进一步阻止dna多聚酶的活性。没有被抗体结合的dna引物/模板复合物将会在有dna多聚酶存在时产生dna多聚酶的产物·双链dna和焦磷酸。在试剂1和试剂2混合后试剂2中的焦磷酸酶抑制剂的功能是当试剂1中的焦磷酸酶完成清除污染的焦磷酸后要及时被抑制，以免其对接下来反应中待测的新生成的焦磷酸水解。

47、s3将s2孵化后的待测样本与试剂3混合后孵育，孵育后由发光仪检测。当试剂3加入到试剂1，样品和试剂2的混合物中后，试剂3中的dna多聚酶会利用试剂2中与抗体结合后剩下来的dna引物/模板以及试剂2中提供的三磷酸脱氧核糖核酸进行反应并产生双链dna以及焦磷酸。

48、优选的，所述s1的孵育条件为温度37℃，时间为10～20min；

49、所述s2的孵育条件为温度37℃，时间为5～20min；

50、所述s3的孵育条件为温度37℃，时间为5～20min。

51、缩写名称解释

52、三磷酸腺苷-atp；

53、焦磷酸-pp i；

54、5'-磷酸硫酸腺苷-aps；

55、单磷酸腺苷-amp；

56、焦磷酸水解酶-ppase；

57、三磷酸脱氧核糖核酸-dntp；

58、磷酸单体-pi。

59、本发明的有益效果：

60、本发明充分考虑了样本中的干扰物质以及在反应过程中产生的干扰物质通过选择试剂1、试剂2和试剂3的成分对每一步反应进行处理，提高了检测的准确性。特别是试剂1中的抗干扰物水解酶、抗干扰物酶抑制剂或焦磷酸酶，试剂2中焦磷酸酶抑制剂、5'-磷酸硫酸腺苷、多聚酶的底物、引物/模板复合物或三磷酸脱氧核苷酸和试剂3中三磷酸腺苷硫酸化酶的存在，消除抗干扰物对检测的影响。