一种检测人血清中重组猴痘病毒A29L蛋白的双抗体夹心ELISA方法

本发明涉及一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，属于环境卫生安全领域。

背景技术：

1、猴痘病毒dna会从唾液、粪便、尿液、精液和皮肤病变中脱落，研究表明，污水和空气中可能存在病毒基因组，这对生态环境和人类健康产生潜在的不利影响，近来成为科学界的研究重点。猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)与天花病毒共属，其宿主范围较广，主要宿主为非洲啮齿类动物和灵长类动物。

2、猴痘病毒a29l是细胞内成熟病毒(imv)表面包膜蛋白，其与痘苗病毒(vacv)a27蛋白同源，是猴痘病毒血清学检测的潜在靶点。为了对环境中猴痘病毒进行定量分析，利用双抗体夹心elisa方法检测人血清中猴痘病毒a29l蛋白的含量。猴痘疫情防控过程中最有效的措施是猴痘病毒的早期诊断，通过提高检测技术的检测速度，检测成本，检测精度以及灵敏度，提前做好疫情防控的充分准备，为猴痘病毒的检测提供帮助。

3、酶联免疫吸附试验是目前最好的抗原检测方法，其基本原理是，用物理吸附的方式，将特定浓度的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯微孔板上，然后添加待检物，通过酶标物的显色程度，间接反映出有无抗原抗体以及数量。夹心法采用双抗体捕捉并固定抗原，在保证灵敏度的前提下，极大地增强了检测的特异性，并且将检测灵敏度提升至pg量级。因此，研制一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法对猴痘病毒的早期诊断以及疫情的传播有很大的作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于建立一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，该双抗体夹心elisa方法具有灵敏度高、操作简便、重复性好、通用性高、可同时对多个样本进行定量分析，可以早期地诊断猴痘病毒，降低潜伏期带来的隐形传播风险，有效控制疫情的大规模传播。

2、为实现上述目的，本发明建立的检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法步骤如下：

3、(1)包被人抗mpxv a29l单抗(b4)：用1×elisa包被液将人抗mpxv a29l单抗(b4)的浓度进行稀释，100μl/孔加到elisa板中，于冰箱中过夜孵育；

4、(2)洗板：将elisa板放入洗板机中，设定好程序，300μl/孔，加入洗液后，振荡1min后，吸走洗液，按照上述步骤重复五次；

5、(3)封闭：封闭液300μl/孔，于37℃恒温箱中孵育2h；

6、(4)洗板：将elisa板放入洗板机中，设定好程序，300μl/孔，加入洗液后，振荡1min后，吸走洗液，按照上述步骤重复五次；

7、(5)加样：将抗原用空白人血清稀释到各个浓度以及空白人血清(抗原阴性对照)，按96孔板排列方式加样，100μl/孔，在200rpm的振动速率下于微孔板恒温振荡器中孵育，温度为室温，时间为1h；

8、(6)洗板：将elisa板放入洗板机中，设定好程序，300μl/孔，加入洗液后，振荡1min后，吸走洗液，按照上述步骤重复五次；

9、(7)加入检测抗体：将hrp标记的人抗mpxv a29l单抗(39)用稀释液进行稀释，按96孔板排列方式加样，100μl/孔，在200rpm的振动速率下于微孔板恒温振荡器中孵育，温度为室温，时间为1h；

10、(8)洗板：将elisa板放入洗板机中，设定好程序，300μl/孔，加入洗液后，振荡1min后，吸走洗液，按照上述步骤重复五次：

11、(9)显色：按照96孔板布局加入tmb单组份显色液，100μl/孔，室温避光孵育10min；

12、(10)终止：按照96孔板布局加入elisa终止液，每孔加入50μl；

13、(11)酶标仪读数：使用酶标仪进行450nm处的比色测定，并将测定值进行统计，绘制曲线，数据处理；

14、所述步骤(1)中，将人抗mpxv a29l单抗(b4)的浓度稀释至2μg/ml；

15、所述步骤(1)中，于冰箱中过夜孵育的温度为4℃；

16、所述步骤(3)中，封闭液为10％bsa-pbs溶液；

17、所述步骤(7)中，选择3％bsa-pbs溶液为稀释液对检测抗体进行稀释；

18、所述步骤(7)中，选择3％bsa-pbs溶液为稀释液对检测抗体进行稀释中，稀释比例为1∶6000。

19、本发明采取以上实验方案，具有以下优点：

20、(1)本发明建立的检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法具有高灵敏度和高特异性，猴痘病毒a29l是一种包膜蛋白，它参与了对病毒的识别，被认为是猴痘病毒免疫测定中最重要的蛋白靶点，结合双抗体夹心elisa方法的操作简便、灵敏度高、重复性好、同时处理多个样本定量分析等优势，可以在猴痘病毒的潜伏期诊断出猴痘病毒，降低潜伏期带来的隐形传播风险，有效控制疫情的大规模传播。

21、(2)该双抗体夹心elisa方法检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白，能够检测的最低阳性样本浓度为0.5ng/ml，重复性实验结果，批内和批间的变异系数均小于15％，表明该方法在检测时有很好的重复性。

22、(3)对建立的检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法进行方法学验证，结果表明，人血清中mpxv a29l蛋白在0.5～32ng/ml范围内线性关系良好，线性相关系数r2均大于0.99，定量下限(lloq)为0.5ng/ml；批内和批间的精密度与准确度、不同条件下的稳定性考察和稀释可靠性考察均在±15％以内，所建立的双抗体夹心elisa方法可以达到对样本进行定量分析的需要。

23、下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

技术特征：

1.一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其具体建立方法如下：

3.根据权利要求2所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：所述(1)中，将人抗mpxv a29l单抗(b4)的浓度稀释至2μg/ml。

4.根据权利要求2所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：所述(1)中，于冰箱中过夜孵育的温度为4℃。

5.根据权利要求2所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：所述(3)中，封闭液为10％bsa-pbs溶液。

6.根据权利要求2所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：所述(7)中，选择3％bsa-pbs溶液为稀释液对检测抗体进行稀释。

7.根据权利要求6所述的选择3％bsa-pbs溶液为稀释液对检测抗体进行稀释，其特征在于：稀释比例为1：6000。

8.根据权利要求2所述的一种检测人血清中重组猴痘病毒a29l蛋白的双抗体夹心elisa方法，其特征在于：对其进行灵敏度检测与重复性实验，并对其进行方法学验证，检测结果均符合生物样品定量分析方法验证指导原则。

技术总结本发明涉及一种检测人血清中重组猴痘病毒A29L蛋白的双抗体夹心ELISA方法，属于环境卫生安全领域。该方法通过优化包被抗体浓度及孵育条件、封闭液、样品稀释液以及检测抗体稀释比例等实验条件，建立方法后进行灵敏度测试与重复性实验，并对方法学进行验证，在提高灵敏度的同时保证方法的准确性以及可重复性。猴痘病毒A29L被认为是猴痘病毒免疫测定中最重要的蛋白靶点，结合双抗体夹心ELISA方法的操作简便、灵敏度高、重复性好、同时处理多个样本定量分析等优势，可以在猴痘病毒感染的初期诊断出猴痘病毒，降低在环境中的传播风险，有效控制疫情的大规模暴发。技术研发人员：刘巍,米泽,张艺璇受保护的技术使用者：天津工业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20