一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条和检测卡

本发明涉及免疫层析检测，尤其涉及一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条和检测卡。

背景技术：

1、布鲁菌病，简称“布病”，是由布鲁菌感染引起的一种危害严重的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内寄生菌，可感染多种动物和人类。根据其感染宿主的偏嗜性，可分为羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌等十二个种。

2、犬作为伴侣动物在我们社会中占有重要地位，随着经济发展和人民生活水平提升，伴侣动物饲养量也逐年增加。在中国，据不完全统计2022年城镇犬猫数量为11655万只，较2021年增长3.7％。其中，犬的数量为5119万只，占比为51.3％，呈持续上升趋势。1986年，国内首次分离出犬种布鲁菌后，临床才找出长期以来部分犬只不孕不育的真正原因。犬布病主要由犬种布鲁菌感染引起，其临诊症状表现为：妊娠期流产、睾丸炎、附睾炎、心内膜炎、葡萄膜炎和椎间盘炎等。大部分犬感染布鲁菌为隐性感染，犬种布鲁菌可通过犬感染人，使人体产生间歇性发热、脾肿大、淋巴结肿大等症状，如不及时治疗，可引起心内膜炎和中枢神经系统疾病。并且，犬布病的治疗过程较长，药物副作用大，且治疗效果较差，易复发。因此，犬种布鲁菌的检测至关重要。

3、但是，犬种布鲁菌由于缺少外膜脂多糖的o抗原结构，使用常规的布病血清学诊断方法不能检测犬种布鲁菌感染，而且目前临床上缺少商用的诊断犬种布鲁菌感染的诊断试剂盒，因此，建立一种快速诊断犬种布鲁菌感染的试剂盒具有重要意义。

4、胶体金免疫层析分析(gica)作为宠物诊断常用的实验技术，无需特殊仪器设备，操作便携，无需专业人员和专业仪器设备，同时随着近些年胶体金技术的不断成熟，其检测结果准确率不断提高，检测时间不断缩短最快仅需10min，并且适用于复杂样本的检测，故gica作为一种无明显短板且兼具可靠、特异、敏感、方便、快捷于一体的免疫学检测技术，对布鲁菌病临床初筛有非常好的应用前景。如何使用gica检测犬种布鲁菌对

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条和检测卡，得到的犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条和检测卡特异性强、灵敏度高可检测犬种布鲁菌，操作便捷，取样简单，结果判定迅速，适用于现场快速检测和初筛，同样适用于非专业人员操作。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括pvc底板，所述pvc底板上依次固定有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有测试线和质控线，所述质控线设置在靠近所述吸水垫的一端。

4、进一步的，所述样品垫搭接在所述金标垫上靠近样品垫一端的上方，所述金标垫的另一端和所述吸收垫靠近所述硝酸纤维素膜的一端分别搭接在所述硝酸纤维素膜的两端的上方。

5、进一步的，所述金标垫为8964玻璃纤维素膜，所述金标垫上固定有浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体。

6、进一步的，所述浓缩胶体金的制备方法包括以下步骤：

7、将10％柠檬酸三钠加入水中，加热至沸腾，然后加入，1％氯金酸，继续搅拌5-10min，降温冷却，得到胶体金溶液；胶体金溶液550×g离心5min后取上清，上清通过8000×g一次离心15min后，分别收集上清和沉淀；一次离心的上清再通过10000×g二次离心15min后，分别收集上清和沉淀；二次离心的上清再通过15000×g离心30min后，弃掉上清，收集沉淀，将三次离心的沉淀混合得到浓缩胶体金；所述10％柠檬酸三钠、水、1％氯金酸的体积比为9:500:5；

8、所述浓缩胶体金在使用时需要与水混合制备浓缩胶体金溶液，混合方法为：每500ml所述胶体金溶液离心后获得的全部浓缩胶体金与50ml水混合。

9、进一步的，所述浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体的制备方法为：在浓缩胶体金溶液中缓慢加入碳酸钾至ph为8.2，按照终浓度20μg/ml将兔抗犬igg加入胶体金中，标记时间30min，加入10％bsa溶液并调节至终浓度至1％封闭30min后，4℃，10000×g高速离心15min弃上清，用复溶工作液按原溶液十分之一的体积进行复溶，得到浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体；所述复溶工作液由10mm tris-hcl、1％bsa、10％蔗糖混合得到，ph＝8.5。

10、进一步的，所述测试线上包被有粗糙型犬种布鲁菌rm6/66株r-lps的抗原。

11、进一步的，所述粗糙型犬种布鲁菌rm6/66株的r-lps的制备方法包括以下步骤：

12、将灭活的湿重3-5g的犬种布鲁菌用25ml蒸馏水溶解，加入22.5ml66℃预热的苯酚溶液，66℃持续剧烈搅拌振荡15min后，冷却至4℃，离心取上清过滤，加入3倍体积的1％饱和醋酸钠与冷甲醇混合溶液，沉淀，离心收集沉淀，将沉淀溶解于20ml蒸馏水中，过滤，取上清，上清中加入dna和rna酶至终浓度为0.01mg/ml，37℃水浴45min，继续加入蛋白酶k溶液至终浓度为0.1mg/ml，55℃水浴3h，升温至80℃，15min灭活蛋白酶k，冷冻干燥，得到犬种布鲁菌rm6/66株r-lps。

13、进一步的，所述测试线上包被的抗原浓度为4mg/ml，包被体积为1μl/cm。

14、进一步的，所述质控线为羊抗兔igg抗体，所述质控线包被羊抗兔igg浓度为1mg/ml，包被体积为1μl/cm。

15、本发明还提供了一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测卡，由外壳和权利要求上述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条组成，所述外壳上对应所述样品垫的位置处设有加样孔，所述外壳对应所述硝酸纤维素膜的位置处设有观察窗。

16、本发明所述的犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条与现有技术相比的有益效果为：

17、本发明利用粗糙型犬种布鲁菌rm6/66株的r-lps制备测试线，利用羊抗兔igg抗体制备质控线，利用浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体制备金标垫，然后与pvc底板、样品垫、吸水垫组合制备犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条。本发明的犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条灵敏度和特异性高，分别为95.23％和98.76％，胶体金诊断试纸条的检测结果与商品化ielisa试剂盒比较分析，诊断符合率达到98.47％，表明本发明的犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条具有较好的临床检测效果。并且利用试纸条或检测卡进行检测，操作便捷，取样简单，结果判定迅速，适用于现场快速检测和初筛，同样适用于非专业人员操作。

技术特征：

1.一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括pvc底板，所述pvc底板上依次固定有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有测试线和质控线，所述质控线设置在靠近所述吸水垫的一端。

2.根据权利要求1所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述样品垫搭接在所述金标垫上靠近样品垫一端的上方，所述金标垫的另一端和所述吸收垫靠近所述硝酸纤维素膜的一端分别搭接在所述硝酸纤维素膜的两端的上方。

3.根据权利要求1所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述金标垫为8964玻璃纤维素膜，所述金标垫上固定有浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体。

4.根据权利要求3所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述浓缩胶体金的制备方法包括以下步骤：

5.根据权利要求3所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体的制备方法为：在浓缩胶体金溶液中缓慢加入碳酸钾至ph为8.2，按照终浓度20μg/ml将兔抗犬igg加入胶体金中，标记时间30min，加入10％bsa溶液并调节至终浓度至1％封闭30min后，4℃，10000×g高速离心15min弃上清，用复溶工作液按原溶液十分之一的体积进行复溶，得到浓缩胶体金标记的兔抗犬igg抗体；所述复溶工作液由10mmtris-hcl、1％bsa、10％蔗糖混合得到，ph＝8.5。

6.根据权利要求1所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述测试线上包被有粗糙型犬种布鲁菌rm6/66株r-lps的抗原。

7.根据权利要求6所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述粗糙型犬种布鲁菌rm6/66株的r-lps的制备方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述测试线上包被的抗原浓度为4mg/ml，包被体积为1μl/cm。

9.根据权利要求1所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条，其特征在于，所述质控线为羊抗兔igg抗体，所述质控线包被羊抗兔igg浓度为1mg/ml，包被体积为1μl/cm。

10.一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测卡，其特征在于，所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测卡由外壳和权利要求1～9任一项所述犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条组成，所述外壳上对应所述样品垫的位置处设有加样孔，所述外壳对应所述硝酸纤维素膜的位置处设有观察窗。

技术总结本发明提供了一种犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条和检测卡，属于免疫层析检测技术领域。本发明利用粗糙型犬种布鲁菌RM6/66株的R‑LPS制备测试线，利用羊抗兔IgG抗体制备质控线，利用浓缩胶体金标记的兔抗犬IgG抗体制备金标垫，然后与PVC底板、样品垫、吸水垫组合制备犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条。本发明的犬种布鲁菌胶体金抗体检测试纸条灵敏度和特异性为95.23％和98.76％，诊断符合率达到98.47％。并且利用试纸条或检测卡进行检测，操作便捷，取样简单，结果判定迅速，适用于现场快速检测和初筛，同样适用于非专业人员操作。技术研发人员：田明星,王少辉,孙鹏翔,祁晶晶,鲍衍清受保护的技术使用者：中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）技术研发日：技术公布日：2024/8/20