一种酶联免疫斑点自动计数方法与流程

本发明涉及电子医疗仪器，更具体地，涉及一种酶联免疫斑点自动计数方法。

背景技术：

1、随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往人们常用酶联免疫吸附试验(elisa)检测体液中游离的细胞因子(ck)或抗体，但由于游离的循环抗体或ck半衰期不同，使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合，而不能确切地反应体内抗体及ck水平。90年代中期，sedgwick、holt和czerkinsky等根据elisa技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和ck分泌细胞的固相酶联免疫斑点(elispot)技术。

2、酶联免疫斑点(elispot)技术由于具有较高的敏感性和特异性，操作简单方便，已日益成为免疫学研究的主流技术，被广泛应用于免疫学相关各领域。而对于酶联免疫斑点的分析，是该技术发展不可或缺的一个环节。

3、现有技术中，主要采用酶联斑点分析仪，该分析仪分析计数不够准确且不能自动去除杂质，所以没有得到广泛应用，现在医生或研究人员直接通过人眼观察每个斑点的特征并数斑点个数，这样不但极大的降低了检测效率，其读取结果也不准确，存在很大的主观性。

技术实现思路

1、本发明提供一种酶联免疫斑点自动计数方法，以解决酶联免疫斑点人工计数工作强度大、成本高且结果精度差的问题。

2、根据本发明的一个方面，提供一种酶联免疫斑点自动计数方法，包括如下步骤，

3、步骤a1，将斑点图转换为灰度图；

4、步骤a2，基于sauvola算法，根据每个像素周围的局部均值和标准差计算阈值，对不同区域具有不同光照条件的灰度图进行二值化；

5、步骤a3，对二值化后的图像用4*4的矩形核，先腐蚀后膨胀，消除细微噪点；

6、步骤a4，以步骤a3获取的图像中心为圆心，以该图像宽度的97%为直径，画圆并将圆外的图像设为白色，然后将图像反色；

7、步骤a5，用分水岭分割算法，找出所有的斑点；

8、步骤a6，计算斑点面积，将面积小于预先设定的面积阈值的斑点剔除，剩下斑点即为所识别出的斑点，对剩余斑点计数。

9、在上述方案的基础优选，所述斑点图为800×800像素。

10、在上述方案的基础优选，所述步骤a2具体包括：

11、以当前像素点为中心，根据当前像素点邻域内的灰度均值与标准方差来动态计算该像素点的阈值；

12、假定当前像素点的坐标为(x,y)，以该点为中心的邻域为r*r范围，设邻域内像素灰度值的均值为mean(x,y)，标准差为std(x,y)，阈值函数可表示为：

13、t(x,y) = mean(x,y) * (1 + k * (std(x,y)/r - 1))，

14、其中：r*r表示邻域范围，取值在19到41之间；k表示比例因子，取值大于等于0；r表示灰度最大标准方差，取值在64到80之间。

15、在上述方案的基础优选，所述步骤a5具体包括：

16、将步骤a4得到的二值图，用3*3的十字核进行膨胀，作为背景图；

17、将步骤a4得到的二值图，用3*3的十字核进行腐蚀，计算白色区域到各像素到中心的距离，然后用距离阈值分割，得到新的白色区域较小的图像，作为前景图；

18、将背景图减去前景图，即可得到多个环，将环上像素设为标记(mark)，然后调用opencv分水岭分割算法，分割出斑点。

19、本发明的一种酶联免疫斑点自动计数方法，采用sauvola算法进行图像二值化，去除噪点及无效区域后，用分水岭分割算法，找出所有斑点，并去除面积过小的斑点，然后计算剩余斑点总数。

20、本发明采用图像处理算法分析酶标板每个孔位照片，来实现自动计数，速度快，一致性高。

技术特征：

1.一种酶联免疫斑点自动计数方法，其特征在于，包括如下步骤，

2.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点自动计数方法，其特征在于，所述斑点图为800×800像素。

3.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点自动计数方法，其特征在于，所述步骤a2具体包括：

4.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点自动计数方法，其特征在于，所述步骤a5具体包括：

技术总结本发明的一种酶联免疫斑点自动计数方法，步骤A1，将斑点图转换为灰度图；步骤A2，用Sauvola算法，通过根据每个像素周围的局部均值和标准差计算阈值，实现对不同区域具有不同光照条件的图像进行二值化；步骤A3，对二值化后的图像进行开运算，消除噪点；步骤A4，以图像中心为圆心，以图像宽度的97%为直径，画圆并将圆外的图像设为白色，然后将图像反色；步骤A5，用分水岭分割算法，找出所有的斑点；步骤A6，用斑点面积过滤掉太小的斑点，对剩余斑点计数。本发明的一种酶联免疫斑点自动计数方法，采用Sauvola算法进行图像二值化，去除噪点及无效区域后，用分水岭分割算法，找出所有斑点，并去除面积过小的斑点，然后计算剩余斑点总数。技术研发人员：张珺,曹强,张玥,刘湘,孙志文受保护的技术使用者：武汉中纪生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/8/20