一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株及其应用

本发明属于生物医药。更具体地，涉及一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株及其应用。

背景技术：

1、弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，可感染包括人在内的几乎所有温血动物。弓形虫感染常引起人和动物的流产和死胎，严重危害人类健康和畜禽养殖业。当前仅有toxovax这一种弓形虫疫苗被批准用于预防绵羊弓形虫病，但该疫苗存在毒力返强和恢复卵囊形成的风险，限制了其广泛地使用。因此，急需研制一种安全、高效的抗弓形虫病疫苗。

2、代谢途径是疫苗靶标发掘与减毒疫苗虫株设计的重要宝库。现有构建的缺失氨甲酰磷酸合成酶cpsii或乳清苷-5’-单磷酸盐脱羧酶ompdc基因的尿苷酸营养缺陷型虫株，只有在含有尿嘧啶的培养条件下生长良好，但虫体无法在小鼠体内建立急性感染，因此毒力严重减弱，具有很好的疫苗潜力。此外，研究发现乳酸脱氢酶ldh介导的乳酸发酵不影响有氧条件下的弓形虫生长，但ldh基因敲除虫株不能在体内繁殖，几乎不具毒力，具有成为减毒活疫苗的潜力；这些研究进展表明：基于代谢途径构建营养缺陷型虫株是研制减毒候选疫苗的一种可行方法。尽管近年来在弓形虫病疫苗研究方面取得了一些令人鼓舞的进展，但当前具备潜力的候选疫苗虫株数量仍非常有限。又由于弓形虫的遗传多样性，单一疫苗虫株的交叉免疫保护常常不足。因此，仍需发掘更多的疫苗设计靶点、研制更多的候选疫苗虫株。

3、三羧酸循环(tca)被认为是弓形虫速殖子的主要能量供应途径，与虫体生长和繁殖紧密相关。tca中的琥珀酸脱氢酶(sdhα)催化琥珀酸生成延胡索酸，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，但sdhα在弓形虫生长和致病的作用尚不清楚，sdhα基因缺失虫株作为疫苗虫株的潜力亦不明了。由此仍需发掘更多的抗弓形虫疫苗或靶点基因，克服现有预防弓形虫感染的疫苗与基因资源的不足。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有预防弓形虫感染的疫苗与基因资源的不足，提供一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株及其应用。

2、本发明的第一个目的是提供一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基(tgsdhα)基因缺失疫苗虫株。

3、本发明的第二个目的是提供tgsdhα缺失疫苗虫株的构建方法。

4、本发明的第三个目的是提供tgsdhα缺失疫苗虫株的的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种抗弓形虫病药物。

6、本发明的第五个目的是提供一种抗弓形虫感染的疫苗。

7、本发明的第六个目的是提供弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基的应用。

8、本发明的第七个目的是提供缺失或敲除弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基的试剂的应用。

9、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

10、本发明提供一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株，所述疫苗虫株通过基因编辑技术直接敲除弓形虫的琥珀酸脱氢酶α亚基(tgsdhα)基因得到；tgsdhα的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、本发明通过研究弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基(tgsdhα)基因对虫体生长与致病中的作用，揭示了tgsdhα作为药物作用靶点或疫苗设计靶点的应用，在敲除虫体tgsdhα后，成功构建得到tgsdhα缺失虫株δsdhα。敲除虫体tgsdhα后，显著影响虫体的生长，减缓生长速度，并能减弱弓形虫的体外的增殖能力，降低体内繁殖数量，该虫株(δsdhα)仍可在体外培养，在体内具有几乎无毒的特性，感染δsdhα虫株的小鼠全部存活；经δsdhα进行动物免疫后，能抵抗野生型弓形虫的感染，具有良好的免疫保护力，还具有毒力减弱的优点，可作为弓形虫疫苗虫株，能用于制备抗弓形虫病药物，为防治弓形虫病提供有效手段与方法。

12、进一步地，通过crispr/cas9基因编辑技术，在亲本dicre虫株上直接敲除tgsdhα，获得基因缺失疫苗虫株。

13、本发明提供tgsdhα基因缺失疫苗虫株的构建方法，包括以下步骤：

14、(1)构建tgsdhα基因crispr敲除质粒pcas9-grna1-grna2-tgsdhα；

15、(2)构建同源重组模板tub::yfp::dhfr*-tgsdhα；

16、(3)将pcas9-grna1-grna2-tgsdhα质粒和同源重组模板共电转至亲本弓形虫虫株中，经药物筛选、pcr鉴定获得弓形虫tgsdhα基因缺失虫株。

17、优选地，步骤(1)中以pcas9-u6-sgmic3质粒为模板，进行同源重组得到骨架片段，再将同源臂进行连接以构建pcas9-grna1-grna2-tgsdhα质粒。

18、更优选地，以pcas9-u6-sgmic3质粒为模板，采用tgsdhα基因的特异性grna引物进行同源重组，分别构建pcas9-u6-5utr-sgsdhα质粒和pcas9-u6-3utr-sgsdhα质粒，再以其作为模板，分别扩增骨架和插入片段，以构建pcas9-grna1-grna2-sdhα质粒。

19、优选地，步骤(2)中以ptub-yfp-dhfr*质粒作为模板扩增同源片段。

20、进一步优选地，步骤(1)中tgsdhα基因的grna引物序列如seq id no.2～3所示。

21、进一步优选地，步骤(2)中tub::yfp::dhfr*-tgsdhα同源片段的扩增引物序列如seq id no.10～11所示。

22、本发明提供tgsdhα基因缺失疫苗虫株在制备抗弓形虫病药物中的应用。

23、本发明提供一种抗弓形虫病药物，含tgsdhα基因缺失疫苗虫株。

24、本发明提供一种抗弓形虫感染的疫苗，含tgsdhα基因缺失疫苗虫株。

25、本发明提供弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因作为靶点在筛选或制备抗弓形虫病药物中的应用。

26、本发明还提供缺失或敲除弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因的试剂在构建基因缺失疫苗虫株或在制备抗弓形虫感染的药物中的应用。

27、优选地，缺失或敲除弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因的试剂为含有tgsdhα基因敲除质粒的载体、或重组菌。

28、本发明具有以下有益效果：

29、本发明提供一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株，该虫株通过基因编辑技术直接敲除弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因得到。敲除tgsdhα基因后，会影响虫体的生长能力，减缓虫体生长速度，但δsdhα虫株仍能在体外培养，并在体内具有几乎无毒的特性，接种后的小鼠仍全部存活；进一步进行动物免疫接种δsdhα后，该疫苗虫株可以产生良好的免疫保护力，能抵抗野生型弓形虫的感染，能用于制备抗弓形虫病的疫苗，以预防弓形虫感染。同时，tgsdhα可以作为弓形虫药物设计靶点，为防治弓形虫病提供更多有效药物与基因资源。

技术特征：

1.一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株，其特征在于，所述疫苗虫株通过基因编辑技术直接敲除弓形虫的琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因得到；所述tgsdhα的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述疫苗虫株，其特征在于，通过crispr/cas9基因编辑技术，在亲本dicre虫株上直接敲除tgsdhα基因，获得基因缺失疫苗虫株。

3.权利要求1或2所述疫苗虫株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中以pcas9-u6-sgmic3质粒为模板，进行pcr扩增得到骨架片段，再将同源臂进行连接以构建pcas9-grna1-grna2-tgsdhα质粒。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(2)中以ptub-yfp-dhfr*质粒作为模板扩增同源片段。

6.权利要求1或2所述基因缺失疫苗虫株在制备抗弓形虫病药物中的应用。

7.一种抗弓形虫病药物，其特征在于，含权利要求1或2所述基因缺失疫苗虫株。

8.一种抗弓形虫感染的疫苗，其特征在于，含权利要求1或2所述基因缺失疫苗虫株。

9.弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因作为靶点在筛选或制备抗弓形虫病药物中的应用，其特征在于，所述tgsdhα基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

10.缺失或敲除弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基tgsdhα基因的试剂在构建基因缺失疫苗虫株或在制备抗弓形虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

技术总结本发明公开了一株弓形虫琥珀酸脱氢酶α亚基基因缺失疫苗虫株及其应用，该虫株(Δsdhα)通过基因编辑技术直接敲除弓形虫的TgSDHα得到；敲除TgSDHα后，显著影响弓形虫的生长，减缓虫体体外的增殖速度，并能降低弓形虫体内繁殖数量；Δsdhα虫株具有体外可以传代培养，体内几乎无毒力的特性，感染Δsdhα虫株的小鼠全部存活；对动物免疫接种Δsdhα虫株后可以产生良好的免疫保护力，能抵抗野生型弓形虫的感染。Δsdhα虫株能用于制备抗弓形虫病的疫苗，为防治弓形虫病提供安全、有效的疫苗候选。同时，TgSDHα可以作为弓形虫药物设计靶点，为防治弓形虫病提供更多有效药物靶标与基因资源。技术研发人员：夏宁波,赵萌,冯耀宇,肖立华,李娜,郭亚琼,元冬娟,许瑞受保护的技术使用者：华南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27