一种生产石竹烯的基因工程菌株及其构建方法

本技术涉及基因工程，具体涉及一种生产石竹烯的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术：

1、萜烯类化合物是一种来源于植物的天然产物，根据碳原子数目的不同，可以分为：单萜，倍半萜，二萜，三萜及四萜；多样的结构使其具有多种生理药理活性，如抗炎，抗氧化，抗肿瘤，杀虫，抗菌等。石竹烯作为一种双环倍半萜化合物，不仅对结肠癌细胞具有抑制作用，同时具有显著的抗真菌活性。此外，石竹烯的甲基侧链与环状结构使其具有高密度，高体积热值等特点，其密度和净燃烧热接近萜烯二聚体燃料。因此，石竹烯也是一种潜在的高密度燃料前体，具有巨大的经济价值。

2、目前石竹烯主要通过传统的植物提取或化学合成获得，不仅效率低而且耗费溶剂，破坏环境，不符合清洁低碳、安全高效的现代能源体系的要求。因此通过植物提取或化学合成获取石竹烯具有挑战性，限制了其商业化生产及应用。

3、因此，亟需一种绿色环保且高产的石竹烯生产方法。

技术实现思路

1、本发明至少从以下方面解决了相关技术的问题之一。

2、本发明第一方面实施例提供一种生产石竹烯的基因工程菌株，其中所述基因工程菌株的出发菌株为酿酒酵母；

3、在所述基因工程菌株的基因组中，第一基因的内源启动子被替换为第一启动子，

4、其中所述第一基因选自由erg9、erg1、erg7和erg11组成的组；

5、所述第一启动子独立地选自由以下组成的组：perg1或与其具有至少85％同一性的变体、perg7或与其具有至少85％同一性的变体、pbts1或与其具有至少85％同一性的变体、phxt1或与其具有至少85％同一性的变体、phxt4或与其具有至少85％同一性的变体、phxt6或与其具有至少85％同一性的变体、phxt7或与其具有至少85％同一性的变体、phxt11或与其具有至少85％同一性的变体；并且

6、所述perg1、perg7、pbts1、phxt1、phxt4、phxt6、phxt7和phxt11来源于所述出发菌株，

7、其中所述基因工程菌株异源表达石竹烯合成基因qhs1。

8、在一些实施例中，在所述基因工程菌株的基因组中，第二基因rgt1的内源启动子被替换为第二启动子，

9、其中所述第二启动子选自由以下组成的组：phxt1或与其具有至少85％同一性的变体、phxt7或与其具有至少85％同一性的变体、pmbp1或与其具有至少85％同一性的变体、pume6或与其具有至少85％同一性的变体、pcin8或与其具有至少85％同一性的变体、pest3或与其具有至少85％同一性的变体、ptho2或与其具有至少85％同一性的变体、prpc31或与其具有至少85％同一性的变体；并且

10、所述phxt1、phxt7、pmbp1、pume6、pcin8、pest3、ptho2、和prpc31来源于所述出发菌株。

11、在一些实施例中，所述基因工程菌株过表达甲羟戊酸途径基因idi1和/或thmg1；优选地，所述甲羟戊酸途径基因来源于所述出发菌株。

12、在一些实施例中，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9的内源启动子被替换为所述perg1或phxt1，所述erg1的内源启动子被替换为所述perg7或phxt1，并且所述erg7的内源启动子被替换为所述phxt1或phxt6；

13、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9的内源启动子被替换为所述perg7或phxt4，所述erg1的内源启动子被替换为所述perg7或pbts1，并且所述erg7的内源启动子被替换为所述phxt11或phxt1；

14、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9的内源启动子被替换为所述perg7或phxt6，所述erg1的内源启动子被替换为所述pbts1或phxt11，所述erg7的内源启动子被替换为所述phxt4或phxt7，并且所述erg11的内源启动子被替换为所述perg7或phxt1；

15、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9、erg1和erg11的内源启动子均被替换为所述perg7；

16、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9、erg1、erg7和erg11的内源启动子均被替换为所述phxt1；

17、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9、erg1、erg7和erg11的内源启动子分别被替换为所述phxt6、phxt1、phxt11和perg7；

18、任选地，在所述基因工程菌株的基因组中，所述erg9、erg1、erg7和erg11的内源启动子分别被替换为所述phxt7、perg7、phxt1和perg7；

19、任选地，所述第一基因为erg9、erg1、erg7和erg11，所述第一启动子独立地选自由perg7和phxt1组成的组，并且在所述基因工程菌株的基因组中，erg9、erg1、erg7和erg11四者的启动子不同时为perg7或phxt1。

20、在一些实施例中，所述第一基因的内源启动子被替换为所述phxt1或与其具有至少85％同一性的变体；并且

21、所述第二基因rgt1的内源启动子被替换为phxt1或与其具有至少85％同一性的变体、pmbp1或与其具有至少85％同一性的变体、pest3或与其具有至少85％同一性的变体、或者prpc31或与其具有至少85％同一性的变体。

22、在一些实施例中，所述erg9、erg1、erg7和erg11的内源启动子均被替换为所述phxt1或与其具有至少85％同一性的变体；并且

23、所述rgt1的内源启动子被替换为所述phxt1或与其具有至少85％同一性的变体、pmbp1或与其具有至少85％同一性的变体、pest3或与其具有至少85％同一性的变体、或者prpc31或与其具有至少85％同一性的变体。

24、在一些实施例中，所述基因工程菌株中半乳糖诱导系统的负调节因子gal80被敲除。

25、在一些实施例中，所述出发菌株为酿酒酵母cen.pk2-1d(saccharomycescerevisia cen.pk2-1d)。

26、在一些实施例中，所述石竹烯合成基因qhs1来源于青蒿。

27、本发明第二方面实施例提供上述第一方面任一实施例的基因工程菌株的构建方法，包括：

28、构建第一调控表达盒，其中所述第一调控表达盒包含所述第一启动子和所述第一基因；

29、构建筛选标记表达盒或第一crispr整合质粒，其中所述筛选标记表达盒包含筛选标记；和

30、将(i)所述第一调控表达盒与所述筛选标记表达盒；或者(ii)所述第一调控表达盒与所述crispr整合质粒，转化到所述出发菌株中，并使其整合到所述出发菌株的基因组，使得所述第一基因的内源启动子被替换为所述第一启动子。

31、在一些实施例中，所述构建方法还包括：

32、构建第二调控表达盒，其中所述第二调控表达盒包含所述第二启动子和第二基因；

33、构建第二crispr整合质粒；和

34、将所述第二调控表达盒与所述第二crispr整合质粒转化到所述出发菌株中，并使其整合到所述出发菌株的基因组，使得所述第二基因的内源启动子被替换为所述第二启动子。

35、本发明的实施例实现了如下有益效果：

36、本发明实施例提供的基因工程菌株与出发菌株相比具有明显提高的石竹烯等倍半萜的生产能力，能够高效合成石竹烯等倍半萜，石竹烯等倍半萜的产量显著提高，具有较好的应用价值。此外，本发明实施例建立的适配于倍半萜高效合成的代谢流分配模式不仅可以用于高效合成石竹烯等倍半萜化合物，而且可以应用于萜烯类化合物的代谢调控，实现其产量的提高。

37、本发明实施例提供的生产石竹烯的基因工程菌株通过将第一基因(石竹烯合成的下游基因erg9、erg1、erg7和erg11)的内源启动子更换为第一启动子(二萜合成相关启动子(pbts1)，甾醇合成相关启动子(perg1、perg7)，葡萄糖诱导的启动子(phxt1、phxt4、phxt6、phxt7、phxt11))，使得代谢流重新分配，从而提高了石竹烯前体的供给，在此基础上，进一步将第二基因(调控转录因子rgt1)的内源启动子更换为第二启动子(phxt1、phxt7、pmbp1、pume6、pcin8、pest3、ptho2、和prpc31)，使得代谢流重新平衡，从而实现了菌株生长和石竹烯生产的最大化，显著提高了石竹烯的产量。

38、本发明实施例通过组合调控石竹烯合成的下游基因(第一基因)和精确调控转录因子(第二基因)使得菌株在代谢流平衡的同时供应大量前体用于合成石竹烯，所获得的菌株遗传性能稳定，适合发酵产业工业化应用。