一种基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法及其应用与流程

本发明属于基因检测，具体涉及一种基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法及其应用。

背景技术：

1、基因突变检测是一种重要的分子生物学技术，它可以用于检测个体体内的基因突变情况。基因突变是指由于dna序列发生改变而导致基因功能发生变异的现象。在人类的遗传疾病中，许多疾病都与基因突变密切相关。

2、对于基因突变的检测，目前使用的方法包括：(1)arms-pcr，其是利用碱基相互配对原则中不能配对的碱基在pcr时不能延伸，从而达到检测突变碱基的目的，(2)探针法pcr、snap-shot、一代测序等相关技术，但是这些技术对百分比含量低的dna模板检测不佳。

3、dna甲基化(dna methylation)实dna化学修饰的一种形式，能够在不改变dna序列的前提下，改变遗传表现。dna甲基化是重要的表观遗传修饰，在生长发育，环境响应和疾病发生，特别是肿瘤发生过程中，都起着重要的作用。

4、对于甲基化检测技术，目前通用的技术是亚硫酸盐转化技术，但是基于亚硫酸盐转化的方法存在许多不足，包括：1、亚硫酸盐转化的dna样本需要经受严苛的化学处理过程，例如低ph、高温、高浓度的重亚硫酸盐等，这些条件会导致dna大量降解，有的甚至降解高达90％，模板完整性降低，因此所需的dna起始用量较大。2、亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全，出现假阳性的结果，从而对dna甲基化情况产生错误的评估。3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95％，将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性，在对多种靶标分子进行同时检测时，引物设计更困难，可能导致检测准确性降低，以及增加检测成本。4、亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐、耗费大量的人力和时间。

5、因此，提供一种操作便捷、可自动化、灵敏度和特异性高的核酸特定位点检测方法在基因检测和甲基化检测领域中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法及其应用。本发明所述方法可以不用亚硫酸盐转化，利用酶切和连接的方法处理后，再进行pcr检测，具有操作时间短、可自动化、灵敏度和特异性高。规避了亚硫酸盐转化的dna断裂、操作时间长、不能自动化等缺点。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法，所述方法包括：采用识别特异性位点的内切酶酶切含有被检测序列的双链核酸片段，所述含有被检测序列的双链核酸片段中含有特定酶切位点，酶切后形成含有特定酶切末端的双链片段，经过变性形成单链序列，所述单链序列为含有特定酶切末端的被检测序列；加入与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段，在dna聚合酶的作用下以酶切变性后的单链序列的3’端为引物，以与酶切位点互补配对的dna片段为模板进行延伸扩增，得到扩增检测模板，再采用特异性探针对扩增检测模板进行检测，含有特定位点的核酸片段的样本有信号输出。

4、本发明应用酶切(含内切酶、甲基化酶)对待测核酸片段进行酶切，在特定的酶切位点切割后，加入与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段，与切割后的dna片段互补后进行延伸，再进行特异性pcr检测。所述检测方法可实现特异性好、灵敏度高的dna甲基化、snp和其他基因突变的检测。

5、优选地，所述特定位点选自含有甲基化、snp或基因突变的位点。

6、优选地，所述特定酶切末端的序列明确。

7、优选地，所述与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段用于捕获单链序列，所述单链序列含有特定酶切末端。

8、优选地，所述与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段从5’到3’由模板延伸序列和结合捕获序列依次连接得到。

9、优选地，所述模板延伸序列用于以切割后的核酸片段的3’末端为引物进行延伸扩增。

10、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，捕获含有特定酶切位点的核酸片段。

11、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对后，以模板延伸序列为模板，以3’末端为引物进行延伸扩增。

12、优选地，所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰。

13、优选地，所述结合捕获序列的碱基数为20-100nt，例如可以是40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt或100nt等。

14、本发明中，设计捕获序列时，捕获序列的碱基数为20-100nt，根据dna杂交理论，在此范围内的长度可以最大限度发挥效果，长于或短于此范围效果不好。

15、优选地，所述核酸延伸阻断修饰位于结合捕获序列的3’端。

16、优选地，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：碳spacer、硫代基团、巯基、pna或氨基。

17、优选地，本发明中，所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰，结合捕获序列的3’端不能含妨碍连接的修饰或碱基，包括不限于如：硫代基团、巯基、氨基、ddatp、ddctp、ddttp、ddgtp、pna或碳c spacer等。

18、优选地，所述扩增检测模板从5’到3’包括酶切末端一侧的核酸片段和与模板延伸序列互补的序列。

19、优选地，所述扩增检测模板的的碱基数为100-500nt，例如可以是100nt、200nt、300nt、400nt或500nt等。

20、本发明中，控制扩增检测模板的碱基数在100-500nt，短于这个长度或长于这个长度，均会降低检测效率。

21、优选地，所述特异性探针用于检测核酸片段样品中是否含有特异性内切酶识别的位点。

22、优选地，所述特异性探针含有与被检测序列上特异性内切酶识别的位点互补配对的序列和/或与模板延伸序列互补配对的序列。

23、优选地，所述特异性探针包括taqman探针、mgb探针、双杂交探针、分子信标探针或蝎形探针中任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，所述特异性探针的5’末端携带荧光基团，3’端携带淬灭基团。

25、优选地，所述荧光基团包括fam、tet、vic、rox、cy5或hex中任意一种或至少两种的组合。

26、优选地，所述淬灭基团包括tamra、bhq或dabcyl。

27、优选地，所述pcr检测采用的扩增引物包括引物一和引物二；所述引物一特异性结合扩增检测模板中的被检测序列，所述引物二特异性结合扩增检测模板中的模板延伸序列。

28、优选地，所述基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法包括：

29、(1)采用识别特异性位点的内切酶酶切含有被检测序列的双链核酸片段，所述含有被检测序列的双链核酸片段中含有特定酶切位点，酶切后形成含有特定酶切末端的双链片段，经过变性形成单链序列，所述单链序列为含有特定酶切末端的被检测序列；所述特定位点选自含有甲基化、snp或突变的位点；所述特定酶切末端的序列明确；

30、所述酶切反应条件为：30±2℃孵育0.5-1.5小时；

31、(2)加入与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段捕获单链序列，所述与酶切位点互补配对的dna片段从5’到3’由模板延伸序列和结合捕获序列依次连接得到；所述模板延伸序列用于以切割后的核酸片段的3’末端为引物进行延伸扩增；所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，捕获含有特定酶切位点的核酸片段；所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰；在dna聚合酶的作用下以酶切变性后的单链序列的3’端为引物，以与酶切位点互补配对的dna片段为模板进行延伸扩增，得到扩增检测模板；

32、(3)所述延伸的反应程序为：95±2℃，30±2s；60±2℃，60±10s，8-12个循环；

33、(4)采用特异性探针对扩增检测模板进行检测，所述特异性探针含有与被检测序列上特异性内切酶识别的位点互补配对的序列和/或与模板延伸序列互补配对的序列；对于含有特异性内切酶识别的位点的核酸片段样本有信号输出，否则无信号输出；

34、所述检测的反应体系中特异引物的终浓度为200-600nm，通用引物的终浓度为200-600nm，特异性探针的终浓度为100-400nm；

35、所述检测的pcr反应程序为：95±2℃预变性2±0.5min；95±2℃，10±2s，62±2℃，45±2s，40-45个循环。

36、第二方面，本发明提供一种基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的基于延伸介导的检测核酸特定位点的方法进行检测；所述特定位点包括识别甲基化的内切酶所特异识别的位点，以及snp上的特异性内切酶所特异识别的位点和基因突变的内切酶所特异识别的位点中任意一种或几种组合。

37、优选地，所述甲基化的内切酶选自abasi、aoxi、bisi、blsl、dpni、fspei、glai、glui、kroi、lpnpi、mali、mspji、mtei、pcsi、pkri或sgei中任意一种或几种组合。

38、优选地，所述试剂盒还包括扩增试剂或检测试剂。

39、第三方面，本发明提供第一方面所述的基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法在核酸检测中的应用。

40、优选地，所述应用包括：甲基化检测、snp的检测或其他基因突变检测。

41、第四方面，本发明提供一种甲基化检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法。

42、优选地，所述试剂盒包括甲基化内切酶、与酶切位点互补配对的dna片段、特异性探针或扩增引物中任意一种或至少两种的组合。

43、优选地，所述甲基化内切酶切割核酸片段后，获得含有特定酶切末端的双链片段，经过变性形成单链序列，所述单链序列为含有特定酶切末端的被检测序列。

44、优选地，所述与含有特定酶切末端的被检测序列互补配对的dna片段从5’到3’由模板延伸序列和结合捕获序列依次连接得到。

45、优选地，所述模板延伸序列用于以切割后的核酸片段的3’末端为引物进行延伸扩增。

46、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，捕获含有特定酶切位点的核酸片段。

47、优选地，所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰。

48、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对后，以模板延伸序列为模板，以3’末端为引物进行延伸扩增。

49、优选地，所述特异性探针含有与被检测序列上甲基化内切酶识别的位点互补配对的序列和/或与模板延伸序列互补配对的序列。

50、优选地，所述扩增引物包括引物一和引物二；所述引物一特异性结合扩增检测模板中的被检测序列，所述引物二特异性结合扩增检测模板中的模板延伸序列。

51、优选地，所述试剂盒还包括扩增试剂或检测试剂。

52、第五方面，本发明提供一种snp的检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法对snp位点进行检测。

53、第六方面，本发明提供一种基因突变检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的基于捕获延伸介导的检测核酸特定位点的方法对基因突变位点进行检测。

54、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

55、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

56、(1)本发明的方法能缩短甲基化检测时间，将有原来的十几个小时检测时间缩短到3小时以内。

57、(2)本发明的方法能提升单碱基突变检测特异性。

58、(3)本发明的方法能提升甲基化检测特异性。

59、(4)本发明的方法可以检测低浓度突变核酸，提升模板检出的最低检测限，具有较高的灵敏度。

60、(5)本发明的方法可以适配微流控设备实现自动化，进行高通量检测。