结肠黑变动物模型的构建方法、结肠黑变动物模型及应用与流程

本发明属于肠道类动物模型，涉及一种结肠黑变动物模型的构建方法；此外，本发明还涉及一种结肠黑变动物模型及其应用。

背景技术：

1、结肠黑变病(melanosiscoli，mc)是指以结肠黏膜黑色素的沉着作为主要特点的非炎症性肠病，实质是结肠黏膜固有层内巨噬细胞中含有大量的脂褐素。近年来结肠黑变病的检出率逐年升高，并且不论男性还是女性均呈逐渐上升的趋势。结肠黑变病的结肠镜表现主要为：结肠黏膜具有程度及范围均不等的色素沉着，结肠黏膜可呈现出网状或是颗粒状的改变，且可弥漫地分布于结肠黏膜或局限地分布于结肠的某段黏膜。

2、结肠黑变病对患者的生活以及心理带来的影响是不容忽视的，尤其是看到肠镜报告单上如豹纹的影像，令人恐惧，并且据相关研究表明，结肠黑变会导致结肠息肉发病率的提升。2009年，大理白族自治州人民医院消化内科和泰安市中心医院在《中国医药导刊》中发表了一篇题目为“结肠黑变病56例临床分析”的文章，文中记载：医院收治的56例结肠黑变患者镜下均表现为黏膜色素沉着，其中6例伴发息肉。因此，开发能够改善结肠黑变的产品意义重大。

3、改善结肠黑变产品的开发、药效评价、安全性评价往往依赖于结肠黑变动物模型的构建。现有技术中构建结肠黑变动物模型的方法采用的是大黄煎液，然而使用大黄煎液构建的结肠黑变动物模型却存在一些不足。2014年，浙江省中西医结合医院消化科的羊燕群等人在《浙江中西医结合杂志》发表了一篇题目为“生大黄致结肠黑变病豚鼠肠动力评估”的文章，文中采用大黄煎液构建豚鼠的结肠黑变动物模型。在造模过程中，大黄组豚鼠前3天大便稀烂量多，第4天开始大便量减少，便质变干。43天造模结束后，大黄组豚鼠消瘦、懒动、触之易怒，且皮毛灰暗、板结、污秽，整体状态不佳；同时，大黄组豚鼠24h内平均大便颗粒数(34.2±8.9)粒，正常组平均(47.1±7.3)粒，即大黄组豚鼠排便颗粒数显著少于正常组与福松组豚鼠排便量(p<0.05)。

4、由前述可知，现有技术采用大黄煎液构建结肠黑变动物模型的方法存在五方面不足。第一方面，模型动物伴随着其他肠道疾病---排便异常，会出现一定的腹泻或便秘，实际结肠黑变的患者不一定伴随有排便异常症状，因此这不利于专属改善结肠黑变产品的开发。第二方面，造模结束后，模型动物在体型、活动度和精神状态三方面均不佳，这不利于最终药效学的评定。第三方面，对于结肠黑变动物模型是否造模成功采用的评价方法为目测结肠外观改变和肠黏膜病理改变，两种指标均存在一定的主观性和不确定性。第四方面，由于需要将大黄中的药效物质转移至煎液中，故在操作人员不同、煎煮工序不同的条件下，导致最终的水煎液药效成分有所差异，致使造模稳定性差。第五方面，实际应用中每天都要给予模型动物大黄煎液，因此每隔几天就需要人工煎煮大黄，致使操作繁琐。

5、综上所述，开发一种造模完成后模型动物不伴随其他肠道疾病、造模完成后模型动物状态佳、造模稳定性更优、造模方法更简便、造模方法评价更客观的结肠黑变动物模型构建方法，成为本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种结肠黑变动物模型的构建方法，本发明采用的技术方案如下：

2、本发明的发明目的之一在于提供一种结肠黑变动物模型的构建方法，所述方法是通过向豚鼠灌胃芦荟混悬液诱导正常豚鼠结肠黑变的发生，构建结肠黑变动物模型。

3、在本发明的一种优选实施方式中，

4、所述豚鼠为清洁级的hartley豚鼠；和/或

5、所述豚鼠的体重为(400±30)g。

6、在本发明的一种优选实施方式中，

7、所述芦荟混悬液由芦荟粉末溶解于混悬剂得到；和/或

8、所述芦荟混悬液中，芦荟的浓度为100～200mg/ml；

9、优选的，所述混悬剂为羧甲基纤维素钠。

10、在本发明的一种优选实施方式中，

11、灌胃芦荟混悬液的时间为连续4周；和/或

12、灌胃芦荟混悬液的次数为每日1次。

13、在本发明的一种优选实施方式中，运用肠组织黑变程度和肠组织病理学检查作为判断结肠黑变动物模型造模成功与否的标准；

14、其中，肠组织黑变程度为对结肠组织中黑变面积进行定量分析；肠组织病理学检查为分别进行he染色和黑色素染色，并对黑色素染色中阳性区域(即黑色素面积)进行定量分析。

15、本发明的发明目的之二在于提供一种由本发明目的之一的构建方法获得的结肠黑变动物模型。

16、在本发明的一种优选实施方式中，所述结肠黑变动物模型出现下列症状

17、结肠黑变相对面积百分比显著增加；

18、结肠黏膜上皮细胞部分脱落，固有层及黏膜下层可见明显中性粒细胞浸润，隐窝及腺体减少，结构紊乱，黏膜肌层与固有层间见较多棕褐色色素颗粒沉着；

19、进行黑色素染色后黑色素区域相对面积百分比显著性增加。

20、在本发明的一种优选实施方式中，所述结肠黑变动物模型的体重无显著变化、摄食量无显著变化、精神状态良好、未出现其他肠道疾病。

21、本发明的发明目的之三在于提供一种由本发明目的之一的构建方法获得的结肠黑变动物模型或本发明目的之二的结肠黑变动物模型在筛选预防和/或改善结肠黑变产品中的应用。

22、在本发明的一种优选实施方式中，筛选预防和/或改善结肠黑变产品包括如下步骤：

23、(1)将候选产品施用于由本发明目的之一的构建方法获得的结肠黑变动物模型或本发明目的之二的结肠黑变动物模型；

24、(2)通过监测结肠黑变动物模型的肠组织黑变程度和肠组织病理学检查的变化，筛选候选产品。

25、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

26、1、本发明结肠黑变动物模型的构建方法所得到的模型动物表现出显著的结肠黑变相关症状，包括：①结肠黑变相对面积百分比显著增加(p＜0.001)；②结肠黏膜上皮细胞部分脱落，固有层及黏膜下层可见明显中性粒细胞浸润，隐窝及腺体减少，结构紊乱，黏膜肌层与固有层间见较多棕褐色色素颗粒沉着；③进行黑色素染色后黑色素区域相对面积百分比显著性增加(p＜0.001)。由此可知，本发明结肠黑变动物模型的构建方法能够有效地诱导正常豚鼠出现结肠黑变。

27、2、本发明结肠黑变动物模型的构建方法所得到的模型动物，在造模过程中和造模完成后均无便秘症状、亦无腹泻症状，即模型动物并未出现其他肠道疾病，这有利于更加单纯地聚焦于结肠黑变的深入研究，使其研究过程免于受到其他肠道疾病的干扰。此处的深入研究包括但不限于改善结肠黑变产品的开发以及结肠黑变疾病机理的研究。

28、3、本发明结肠黑变动物模型的构建方法，整个造模过程中模型动物的体重、摄食量均无显著变化，整体生理状态较好，皮毛顺滑有光泽，即本发明的方法并未影响模型动物的体重、摄食量、精神状态，所得到的模型动物并无干扰因素，有利于结肠黑变产品开发过程中的药效学评定。

29、4、本发明结肠黑变动物模型的构建方法，采用的是芦荟粉末，并不涉及将固态物中的药效物质转移至液态煎液中，造模时药效成分含量稳定，重复性好，造模稳定性更佳、造模成功率更高。本发明进一步明确了采用芦荟粉末造模的具体用量，即给予豚鼠100mg/kg～200mg/kg的芦荟粉末后，可造成豚鼠结肠明显黑变。

30、5、本发明结肠黑变动物模型的构建方法，采用的是芦荟粉末，不需要每隔几天进行人工煎煮，造模方法操作简便。

31、6、本发明结肠黑变动物模型的构建方法，对于模型动物肠组织黑变程度的评价，对结肠组织中黑变面积进行定量，得到结肠黑变相对面积百分比，再采用统计学分析方法进行定量分析，尽可能弱化了评价方法的主观性，使得模型动物肠组织黑变程度的评价方法更客观、更确定；对于模型动物肠组织病理学的评价，对黑色素染色中的阳性区域进行定量，得到黑色素区域相对面积百分比，从而将黑色素染色的阳性区域进行定量分析，尽可能弱化了肠组织病理学的主观性，使得模型动物肠组织病理学的评价方法更客观、更确定。由此可知，本发明结肠黑变动物模型采用宏观定量与微观定量相结合的评价方法，有利于更客观、更确定地评价结肠黑变动物模型是否构建成功。