一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂及其制备方法和应用

本发明涉及水产动物疾病防治领域，具体的说是一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、指环虫(dactylogyrus)属于单殖吸虫纲(monogenea)，在鲤、鲫、草、鲢、鳗、鳜等多个养殖鱼类品种上均有寄生，在养殖环境中增殖和传播迅速。寄生在鱼类鳃部，导致鳃组织损伤，吮吸鱼血、体液，与宿主争夺营养，使其易受其他病原感染而暴发疾病，导致批量死亡，平均死亡率为20％-30％，指环虫病是淡水养殖鱼类中危害严重的高发疾病，每年都会因指环虫病暴发给渔民带来重大经济损失。指环虫为雌雄同体，通过固着器粘附在鱼类腮片上，整个生活史包括虫卵-孵化-纤毛幼虫-寄生-成虫-虫卵几个阶段，其生活史简单，无中间宿主。在水温20-24℃时，成虫15分钟可产卵1次，繁殖能力强，甚至发现成虫在药物刺激下死亡前仍可大量产卵的情况，卵可附着在鱼鳃上或在水体中孵化出幼虫，幼虫在水中寻找新的寄主，如15-40min不能吸附在寄主上，将耗尽体力而死亡。指环虫的感染方式主要有两种：第一种是由自由游泳的纤毛幼虫从水体中直接吸附到寄主上而完成，是主要的感染方式；第二种是在鱼体相互接触时由已感染的寄主转移到新的寄主上。成虫如因药物或其它原因从鱼鳃脱落，一般不能重新抓住鳃片，不再有感染能力，而幼虫则可重新黏附在鱼鳃。

2、目前，主要采用泼洒和药浴的方式对指环虫病进行治疗，在实践中发现，对于池塘等封闭小水体鱼类养殖，采用多次全池泼洒的方式即可有效控制病情，但是对于网箱和大水面等开放水体，由于水面大或者水体交换过快，只能采取药浴或挂袋的方式进行预防或治疗，往往治疗效果较差。指环虫病预防和治疗常用的药物主要有敌百虫、吡喹酮、甲苯咪唑、高锰酸钾、甲醛等化学药剂以及中药及其提取物，目前使用的药物对指环虫病均有一定的疗效，治愈率40-95％不等(李振龙.指环虫病[j].中国水产，2011(10):48-49)，但实践中发现，指环虫病控制病情容易、彻底治愈很难，这和其生长史以及虫卵难以彻底杀死有密切关系，特别在网箱养殖过程中，由于养殖鱼类聚集，单位体积密度远超池塘，客观上给指环虫病的感染和传染创造了条件。网箱养殖鱼类感染指环虫后，经药浴治疗后鱼类进入养殖水体，体表药量经水稀释后几乎可忽略不计，不能对鱼类提供持续的保护作用，虫卵和药物刺激脱落的虫体重新感染，并迅速繁殖，结果是用药则病情减轻，停药即复发的被动局面。一年中反复多次用药，导致抗药性问题日益加重，形成恶性循环。指环虫病治疗存在的第二个问题是大多数药物毒性大，药物无效浓度、有效浓度和鱼类中毒浓度很接近，如以马尾松叶、辣蓼、苦楝、乌桕叶、雷丸等为原料，配伍成复方中草药治疗患指环虫病的红鲫，5g/l中草药合剂对指环虫的杀灭效果不太理想，8g/l可有效杀灭指环虫，对红鲫未产生毒害，使用l0 g/l虽可杀灭指环虫，但也引起鱼类死亡(朱定贵.复方中草药防治观赏鱼指环虫病研究[j].安徽农业科学，2010，38(6):2977-2978.)，用量小达不到治疗目的，用量大易引起鱼类死亡，得不偿失，药物使用风险大。指环虫病治疗存在的第三个问题是大部分治疗药物所需药浴时间过长，往往需24h，甚至更长时间，如分别使用银杏外种皮、杠柳、博落回、重楼、小果博落回、鸦胆子、陈皮、槟榔等中药提取物治疗指环虫病，最高杀虫率均达70％以上，对鱼安全性较高，但治疗时间将近48h(王高学，徐钰，王建华，等.29种天然植物提取物对指环虫杀灭作用的研究[j].淡水渔业，2006，36(3):3-8.)，这适应于水族箱等单位密度小、易于增氧、换水的水体，而对于单位密度大的网箱则容易导致鱼类在药浴过程中缺氧或药物中毒而死亡，实践应用价值不高。

3、鉴于上述问题，有必要发明一种安全、治愈率高、复发率低、药浴时间短的指环虫病预防和治疗药物。

4、微胶囊技术(microencapsulation technology)是指利用天然的或合成的高分子材料包覆分散的固体、液体物质，甚至是气体，形成一种具有半透性或密封囊膜的微粒技术。微胶囊技术在医药、食品、化妆品、畜牧、水产等方面均得到了广泛的应用，具有对药物保护、缓释、降低毒副作用等多种作用，在水产动物外用药物方面尚未见报道。

5、高锰酸钾、有机磷农药、甲苯咪唑等化学药物对指环虫的杀灭效果较好，但化学药物的副作用大、易残留、可造成环境及鱼肉蛋白污染，增加指环虫耐药性等，在防治淡水鱼指环虫病方面备受诟病(任景坤，弓飞龙，黄元华.三代虫、指环虫病几种治疗药物分析[j].科学养鱼，2006(6)：52-53)。中药具有纯天然、毒性小、不易残留等优点，在一定程度上克服了化学药物的弊端。如申请号201510525695.x的发明专利申请公开了一种防治鱼寄生虫病的中药制剂，由艾草、辣蓼、槟榔、苦楝叶即时煎煮后使用，其无残留，环境友好，但其药剂用量大、使用繁琐，且高温煎煮会破坏原料中的活性成分，油溶性成分利用率低。申请号201510829940.6的专利公布了一种防治鱼类指环虫病的重要组合物，采用多种中药提取物对指环虫病进行治疗，具有使用便利，所使用原料绿色安全、对鱼和人体无害等优点，但药浴后鱼类进入养殖水体，药物不能对鱼类进行持续防护，存在二次感染的风险，适用范围有限。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂及其制备方法和应用，以延长药物在鱼体表面的停留和释放时间。

2、为了解决以上技术问题，本发明采用的具体方案为，一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂的制备方法，包括以下步骤：

3、s1，将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得壳聚糖溶液；分别将海藻酸钠、2,3,4-三羟基苯甲醛和氯化钙溶于水中，得海藻酸钠水溶液、2,3,4-三羟基苯甲醛溶液和氯化钙溶液，备用；

4、s2，取博落回提取物、银杏果皮提取物、独活提取物、吴茱萸提取物、槟榔提取物、川楝提取物、大黄提取物、黄连提取物、黄柏提取物和五倍子提取物，溶入70-80％的乙醇溶液中，得中药提取物溶液；

5、s3：边搅拌边向海藻酸钠水溶液中加入中药提取物溶液、吐温-80和司班-80，高压均质、高速剪切，得中间溶液ⅰ；将中间溶液ⅰ、壳聚糖溶液与蒸馏水混合，超声凝聚，得到中间溶液ⅱ，再向中间溶液ⅱ中依次加入2,3,4-三羟基苯甲醛溶液和氯化钙溶液，静置，过滤取沉淀，干燥，得微胶囊药a；其中，中间溶液ⅰ和壳聚糖溶液的体积份数之和与蒸馏水的体积份数相等；将中间溶液ⅰ、壳聚糖溶液与蒸馏水混合并进行超声凝聚的过程中，即以融入乙醇中的中药提取物为芯材，壳聚糖和海藻酸钠作为壁材，在超声波辅助下采用复凝聚法制备得到了微胶囊，所得到的中间溶液ⅱ为含有微胶囊的溶液，加入2,3,4-三羟基苯甲醛能够与壳聚糖进行希夫碱反应和交联反应，从而对微胶囊进行修饰，加入氯化钙用于使交联反应后的溶液固化，最后经过静置，过滤取沉淀，干燥，得微胶囊药a；

6、s4：取博落回提取物、银杏果皮提取物、独活提取物、吴茱萸提取物、槟榔提取物和川楝提取物，混合，得药b；

7、s5：将药a和药b混合，即得用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂。

8、作为上述技术方案的进一步优化，壳聚糖溶液、海藻酸钠水溶液、2,3,4-三羟基苯甲醛溶液和氯化钙溶液的质量浓度均为0.7％，壳聚糖溶液的ph值为3.0-4.0。

9、作为上述技术方案的进一步优化，步骤s2具体为，按照重量份数，取博落回提取物18-22份、银杏果皮提取物12-18份、独活提取物7-13份，吴茱萸提取物12-18份、槟榔提取物5-10份、川楝提取物3-8份、大黄提取物8-12份、黄连提取物4-8份、黄柏提取物6-10份和五倍子提取物8-12份，混合，按照重量体积比(g:ml)1:2-3的比例溶入70-80％的乙醇溶液中，即得中药提取物溶液。

10、作为上述技术方案的进一步优化，步骤s3具体为，

11、s301，按照体积份数，取1500份质量浓度为0.7％的海藻酸钠水溶液，加入高压均质机中，加热至50-60℃，边搅拌边加入14-21份中药提取物溶液、8-12份吐温-80和4-6份司班-80，完全加入后，在50-60℃，高压均质压力为20mpa-30mpa，转速2500-3500r/min的条件下高速剪切20-30min，用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至3.0-4.0，得中间溶液ⅰ；

12、s302，按照体积份数，取100份质量浓度为0.7％的壳聚糖溶液和100-150份中间溶液ⅰ，边搅拌边加入200-250份蒸馏水中，完全加入后，继续在40℃，超声功率40w条件下搅拌反应20-30min，得中间溶液ⅱ；

13、s303，按照体积份数，取15-25份质量浓度为0.7％的2，3，4-三羟基苯甲醛溶液，边搅拌边加入400份中间溶液ⅱ中，完全加入后，继续搅拌40-60min，得中间溶液ⅲ；

14、s304，取质量浓度为0.7％的氯化钙溶液，按照氯化钙溶液与中间溶液ⅲ体积比1:8-10的比例混合，在40℃，超声功率40w条件下反应20-40min，用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至6.0，然后在4℃静置60-80min，过滤取沉淀，40℃真空干燥24-30h，即得微胶囊药a。

15、作为上述技术方案的进一步优化，步骤s4具体为，按照重量份数，取博落回提取物18-22份、银杏果皮提取物12-18份、独活提取物7-13份、吴茱萸提取物12-18份、槟榔提取物5-10份和川楝提取物3-8份，混合，粉碎，即制得药b。

16、作为上述技术方案的进一步优化，药a和药b的重量比为1:2-4。

17、作为上述技术方案的进一步优化，所述大黄提取物、五倍子提取物的制备方法为，分别将大黄、五倍子在70-80℃烘箱内干燥，粉碎，放入带有搅拌装置的提取罐中，按照重量体积比(g:ml)1:15的比例加水，加热，控制温度在70-80℃，浸提，过滤除去药渣，滤液浓缩，干燥后粉碎，即制得大黄提取物和五倍子提取物。

18、作为上述技术方案的进一步优化，所述黄柏提取物、黄连提取物的制备方法为，分别将黄柏粉末、黄连粉末和50％乙醇溶液按照重量体积比(g:ml)1:10的比例混合，在超声波功率250-350w，2.5-3.5w/ml，频率20-40khz，温度45-55℃，搅拌转速80-120rpm/min的条件下提取50-70min，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣，将滤液浓缩，冷冻干燥，粉碎，即制得黄柏提取物和黄连提取物；

19、所述独活提取物、吴茱萸提取物、银杏果皮提取物、槟榔提取物、川楝提取物、博落回提取物的制备方法为，分别将独活粉末、吴茱萸粉末、银杏果皮粉末、槟榔粉末、川楝粉末、博落回粉末和无水乙醇溶液按照重量体积比(g:ml)1:10的比例混合，在超声波功率250-350w，2.5-3.5w/ml，频率20-40khz，温度45-55℃，搅拌转速80-120rpm/min的条件下提取50-70min，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣，将滤液浓缩，冷冻干燥，粉碎，即制得独活提取物、吴茱萸提取物、银杏果皮提取物、槟榔提取物、川楝提取物和博落回提取物。

20、如上述制备方法得到的用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂。

21、一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂在制备预防和治疗鱼类指环虫病药物中的应用。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明所述的一种用鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，具有延长药物作用时间的作用。鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂克服了常规鱼用药浴制剂入水散失的缺点，使药物形成微胶囊并粘附在鱼体表面、鱼鳃，具有延长药物在鱼体表面、鱼鳃的停留和释放时间，药浴后仍可持续杀灭指环虫。将治疗指环虫的药物包裹在海藻酸钠和壳聚糖形成的微胶囊中，加入2，3，4-三羟基苯甲醛和壳聚糖反应，增加了微胶囊的稳定性和在水中的溶解性，同时增加了微胶囊和鱼体表面尤其是鱼鳃的粘附性，药物通过微胶囊上的微孔或胶囊慢慢降解破裂缓慢释放药物，达到持续保持药物浓度，预防、治疗鱼类指环虫病的目的。

23、本发明所述的一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，对鱼类指环虫病具有良好的预防作用，能显著降低指环虫的二次感染、降低用药次数和指环虫病的发病率。鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂对指环虫具有生物屏障作用，可有效抑制幼虫和成虫在鱼鳃上的黏附感染，不仅在药浴时发挥作用，而且入水后黏附在鱼体表面和鱼鳃上，在皮肤表面和鱼鳃上形成透明、透气及有弹性的保护层，药物通过微胶囊上的微孔或胶囊慢慢降解破裂缓慢释放药物，使得指环虫成虫和幼虫不敢靠近，从而有效避免成虫和幼虫感染和药物治疗后脱落的成虫和幼虫再次感染，幼虫由于不能感染寄主，在1-3天自然死去。根据指环虫的生活特性，成虫不易附着鱼鳃，幼虫附着能力强的特点，配方中加入对幼虫具有良好杀灭能力的多种中药提取物，该特性尤其适合指环虫病的预防。

24、本发明所述的一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，对鱼类指环虫病具有良好的治疗作用。淡水鱼药浴中药制剂由药a和药b组成，淡水鱼药浴中药制剂药b中的博落回、银杏果皮、独活对指环虫均具有良好的杀灭作用，含有丰富的黄酮、生物碱、甾醇类、甙类等生物活性物质，进行提取后，药物浓度提高，多靶位、快速杀灭指环虫；药a包裹在微胶囊中，微胶囊保护药物活性成分不被破坏，药浴后药物慢慢释放，持续发挥杀虫作用，有利于发挥药物长效作用和阻止指环虫的再次感染，将进行胶囊化处理的药a和药b联合使用，可同时发挥两者的优点，达到良好的治疗效果。

25、本发明所述的一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，对鱼类安全，无毒副作用，具有提高药效，减少药物用量，降低药物毒性和副作用，使用方便的优点。中草药成分复杂，起到防治指环虫病作用的成分往往仅占一部分，且某些成分对指环虫病的防治具有拮抗作用，鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂由多种中草药根据其药理活性、指环虫病特点，科学配伍而得，中草药不同成分间相互配伍而产生不同疗效，成分复杂的中草药具有多方面防治效果，使指环虫不易产生耐药性，将药物活性成分成分提取后可降低中草药使用的不可控性，又可改进中草药的传统用药形式，简便用药流程，提高药物利用率。

26、本发明所述的一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，对淡水鱼多种病原菌具有有效抑制杀灭作用，可有效预防和治疗指环虫病引起的多种继发疾病。药浴中药制剂中的大黄、黄连、黄柏、五倍子均为传统鱼类广靶杀菌药物，含有丰富的黄酮、生物碱、甾醇类、甙类等生物活性物质，次生代谢产物丰富，是作用于多种靶点的化合物组合库，实践中已广泛应用于嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、水霉菌等引起的出血性败血症、水霉病等的预防和治疗中，且取得了良好的效果，可有效预防和治疗指环虫侵袭引起鱼类受伤或免疫力降低而导致的多种继发性疾病。

27、本发明所述的一种用于鱼类指环虫病预防和治疗的药浴中药制剂，由海藻酸钠、壳聚糖形成的微胶囊，和鱼体皮肤具有良好的生物相容性、可降解性、透气性，其资源丰富多样、可再生，对皮肤无刺激、无毒，对环境安全无害，具有功能性缓释性、局部粘附滞留性的特点，使药物更好地发挥治疗作用。使用的中草药均为市场上常见的中草药品种，绿色天然，价廉易得，添加到饲料中，无富集，无残留，不污染水体。