检测ASFV感染早、晚期抗体水平的间接ELISA试剂盒及检测方法

本发明属于生物工程，具体涉及检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染家猪和野猪引起的一种烈性传染病，临床上表现为高热、沉郁、厌食、皮肤发绀、各脏器出血，发病率和病死率可高达100％。该病自2018年首次传入我国后，迅速大范围蔓延，对我国养猪业构成了重大威胁。

2、asfv为有囊膜的双链dna病毒，是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(asfivirus)的唯一成员。该病毒基因组全长约170-194kb，编码150-200种蛋白。由于目前仍缺乏有效的asf疫苗，早期的猪群检测及生物安全防控仍是预防asf的主要手段。而elisa抗体水平的检测方法能够准确及时的检测猪体内病毒抗体水平，判断猪群感染情况从而有助于更有效的制定非洲猪瘟的防控措施。有研究显示，p72、p30和p54蛋白为asfv感染过程中能引起体液免疫应答的最重要的3种抗原蛋白。针对p72和p54蛋白的抗体可以阻止病毒吸附，针对p30的抗体可以阻止病毒内吞。因此，这些蛋白常被作为用于asf血清学诊断及疫苗研制的重要抗原蛋白。

3、p72蛋白又称vp72蛋白，是asfv的主要结构蛋白，是由基因b646l编码的关键抗原蛋白，相对分子量为73.2kda。p72约占病毒颗粒总重量的32％，具有高度的抗原性和反应原性，是病毒二十面体的主要成分，并且对病毒衣壳的形成起着十分重要的作用。该基因的表达发生在病毒感染的晚期，并受病毒晚期启动子的调节，合成晚期蛋白。新合成的p72均匀分布在可溶性细胞质池和与内质网(er)结合的膜相关池之间，并组装在er膜上形成大的衣壳或基质前体。p72蛋白在非洲猪瘟病毒入侵过程中具有构象依赖性，其表达是病毒复制的标志。p72抗体可以阻止asfv与巨噬细胞结合，但该抗体在抗体介导的免疫保护中不能发挥决定性作用。而p72蛋白的反应原性很稳定，且不同区域所分离出的非洲猪瘟病毒株诱导机体产生的抗p72蛋白抗体的相应抗原表位都十分保守，可以作为血清学检测方法及疫苗研制的良好抗原。

4、p30蛋白由cp204l基因编码，是一种早期的病毒蛋白质，与asfv入侵和内化作用相关，其分子量为26kda，在病毒感染后约2至4小时可观察到该蛋白的高度表达，并且能持续整个病毒感染周期。p30的表达表明asfv已经进入宿主细胞并脱壳，是病毒早期基因开始表达的标志。研究发现，重组p30蛋白在elisa抗体检测中的效果优于p54蛋白。因此，在asfv的检测中经常把p30作为elisa(酶联免疫吸附)检测的主要抗原，把p54作为western blot(免疫印迹)检测宿主血清中asfv抗体的指定抗原。

5、asfv感染后8-12天可检测到p30抗体，比其他蛋白抗体检出时间早1周左右，可判断病毒早期感染情况，但其持续时间短，抗体水平消减快。而asfv感染后第17天可检测到p72抗体，其持续时间长，抗体水平高，可判断病毒的持续感染情况。而如果能同时检测p30和p72抗体，从而将早期感染以及持续感染情况进行有效结合，将明显提高asfv感染的检出率。然而，现有技术中，通常只针对一种抗体进行检测，仍然缺少能够同时实现p30抗体和p72抗体高灵敏度检测的配套方法。并且，采用现有检测方法，无法同时实现asfv感染早、晚期抗体水平的有效检测，也无法精准判断猪群的病毒持续感染情况，限制了其在asf疫病防治方面的应用。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa试剂盒，其采用p72δ-p30融合蛋白作为包被抗原，基于该融合蛋白进行elisa间接检测asfv抗体水平，具有快速、特异、灵敏的特点，能够有效检测asfv感染早、晚期抗体水平，从而为asfv诊断试剂的开发提供参考。

2、本发明的目的还在于提供一种检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa方法，其具有快速、特异、灵敏的特点，能够有效检测asfv感染早、晚期抗体水平，从而为asfv诊断试剂的开发提供参考。

3、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

4、一种检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa试剂盒，所述间接elisa试剂盒包括：包被酶标板、酶标二抗；

5、所述包被酶标板以p72δ-p30融合蛋白作为包被抗原；所述p72δ-p30融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、其中，p72δ-p30融合蛋白的氨基酸序列，全长389aa。其中，第1～190aa段为p72δ的氨基酸段；第191～195aa段为连接蛋白linker的氨基酸序列；第196～389aa段为p30的氨基酸段。

7、作为优选的方案，所述p72δ-p30融合蛋白由如seq id no.2所示的核苷酸序列编码。seq id no.2所示的核苷酸序列全长1191bp。其中，第1～3bp、1171～1191bp位点处的核苷酸是扩增时质粒中含有的、为了方便扩增并起到保护作用的核苷酸，并不会在表达的时候编码蛋白质。第4～573bp位点处核苷酸编码p72δ蛋白；第589～1170bp位点处核苷酸编码p30蛋白。第574～588bp位点处的核苷酸为flexible linker(ggggs)的编码核苷酸(ggcggcggcggttct)。

8、作为优选的方案，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗猪igg抗体。

9、作为优选的方案，所述间接elisa试剂盒还包括：阴性对照血清、阳性对照血清、包被液、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液。

10、作为进一步优选的方案，所述阴性对照血清为asfv阴性血清；所述阳性对照血清为asfv阳性血清；所述包被液为含20mm na2co3、35mm nahco3的水溶液，ph值为9.6；所述洗涤液为pbst缓冲液；所述显色液为tmb显色液；所述封闭液为3％bsa封闭液；所述稀释液为pbst缓冲液；所述终止液为2mol/l硫酸溶液。

11、作为优选的方案，所述p72δ-p30融合蛋白通过包括如下步骤的方法制备：

12、(a)以重组质粒pet-28a-p72、pet-28a-p30为模板，分析p72和p30的优势抗原表位，根据genbank数据库收录的登录号为mk128995.1的非洲猪瘟病毒anhui株全基因组中的p72、p30序列，设计融合pcr的特异性引物；

13、利用特异性引物对p72δ、p30目的基因进行pcr扩增，pcr产物经过纯化，得到目的基因p72δ和p30；将目的基因p72δ和p30进行同源重组pcr扩增，pcr产物经过纯化，得到目的基因p72δ-p30；

14、(b)将纯化好的p72δ-p30目的基因插入pet-28a载体，经阳性克隆筛选和测序鉴定，得到重组表达质粒pet-28a-p72δ-p30；

15、(c)将重组表达质粒pet-28a-p72δ-p30转化至原核表达感受态rosetta细胞中，诱导表达目的蛋白，纯化后分析目的蛋白的纯度，即得p72δ-p30融合蛋白。

16、作为进一步优选的方案，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：

17、p72δ-f：5'-ccgggatccaaaatgactggatataagcactt-3'(如seq id no.3所示)；

18、p72δ-r：5'-agagccgccaccgcc attattcgtgagcgagattt-3'(如seq id no.4所示)；

19、p30-f：5'-ggcggtggcggctct atggattttattttaaatat-3'(如seq id no.5所示)；

20、p30-r：5'-ccgctcgagtgtaggtgagataaaagc-3'(如seq id no.6所示)。

21、一种检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa方法，包括以下步骤：

22、(1)抗原包被：采用包被液稀释如权利要求1所述的p72δ-p30融合蛋白，然后将融合蛋白的稀释液加入到酶标板中，4～6℃过夜进行抗原包被，结束后采用洗涤液清洗；

23、(2)封闭：在酶标板中加入封闭液，35～40℃封闭0.8～1.2h，然后弃去封闭液，采用洗涤液清洗；

24、(3)加样：将待测样品、阴性对照血清和阳性对照血清采用稀释液按比例稀释后，分别加入酶标板的孔内，35～40℃孵育20～40min，然后弃去孔内血清，采用洗涤液清洗；

25、(4)加酶标二抗：将酶标二抗采用稀释液稀释，然后以80～120μl/孔加入酶标板，35～40℃孵育0.5～2h，弃去酶标二抗，采用洗涤液清洗；

26、(5)显色、终止、判定：在酶标板中加入tmb显色液，加入量为80～120μl/孔，35～40℃避光显色8～15min，然后立即向酶标板中加入终止液，采用酶标仪读取od450nm值；根据测定的od450nm值，判定待测血清样品中是否含有asfv的抗体。

27、本发明的检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa方法，仅用于检测待测样品中是否含有asfv的抗体，并不用于该动物疾病的直接诊断。该方法中，待测样品一般可以是猪血清、唾液或分泌物。

28、作为优选的方案，所述间接elisa方法的最佳工艺条件为：步骤(1)中，抗原包被的浓度为1μg/ml，融合蛋白的稀释液在每孔的加入量为100μl/孔；包被液为含20mm na2co3、35mm nahco3的水溶液，ph值为9.6；包被条件为4℃过夜；步骤(2)中，封闭液为3％bsa封闭液，封闭时间为37℃、1h；步骤(3)中，所述稀释的倍数为1：1000，所述孵育的条件为37℃、30min；步骤(4)中，所述稀释的倍数为1：5000，所述孵育的条件为37℃、60min；步骤(5)中，所述显色的条件为37℃、10min。

29、作为进一步优选的方案，步骤(5)中，判定待测血清样品中是否含有asfv的抗体，具体是：当od450nm值≥0.457时，判定待测血清样品为阳性，即待测血清样品中含有asfv的抗体，说明该动物已感染asfv；当od450nm值<0.457时，判定待测血清样品为阴性，即待测血清样品中不含asfv的抗体，说明该动物没有被asfv感染。

30、本发明的有益效果在于：

31、本发明提供的检测asfv感染早、晚期抗体水平的间接elisa试剂盒及检测方法，将afsv两个重要的病毒蛋白p72和p30进行融合表达，同时通过控制融合蛋白的融合顺序，成功纯化出p72δ-p30融合蛋白，利用该融合蛋白作为包被抗原，建立了一种间接elisa检测方法，该方法能够实现同时对p72和p30抗体水平的检测，能够为感染早期和晚期抗体水平的评估提供全面的数据支持，而且该方法具有良好的特异性和稳定性，可运用于非洲猪瘟临床血清检测的运用，为建立血清学间接elisa方法检测非洲猪瘟奠定了坚实的基础。

32、试验证实，相较于现有的asfv抗体检测方法，本发明通过将p72保守抗原和p30蛋白融合表达，具有更高的检出率，用于临床诊断后可精准判断猪群的病毒持续感染情况，能够为asf疫病防治措施制定提供科学依据。