基于氧化银漆酶活性比色检测EC的方法与流程

本发明属于氨基甲酸乙酯的检测，具体涉及一种基于氧化银漆酶活性比色检测ec的方法。

背景技术：

1、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,ec)主要是发酵过程中由乙醇、尿素、瓜氨酸和氨基甲酰磷酸等产生和贮存下来的小分子化合物，其广泛存在于酒精饮料和发酵食品当中。2007年末，国际癌症研究机构将其升级为可能的人类致癌物(2a类)。氨基甲酸乙酯是一种有毒的氮代谢物，具有神经毒性和强致癌性。长期接触ec可导致人类神经系统疾病和肝脏损伤。然而，只有部分国家，如加拿大、韩国和某些欧盟成员国制定标准酒精饮料中最大允许残留量为150μg·l-1。综上所述，建立起检测氨基甲酸乙酯的新方法具有重要意义。迄今为止，很多研究人员针对于氨基甲酸乙酯主要是通过大型仪器进行检测，如气相色谱-质谱联用(gc-ms)，高效液相色谱法(hplc)、同位素稀释气相色谱-质谱法(id gc-ms)等检测方法。虽然大型仪器具有较高的灵敏度和特异性，但是需要较长的检测时间和专业的技术操作人员，前处理时间较长，定期维修设备费用昂贵，这些不足限制了它们在现场大批量初筛酒精饮料和发酵食品中的ec的运用。

2、立方体氧化银(ag2o)纳米颗粒具有良好的物理、化学、电子特性。同时也具有良好的催化活性、稳定性和环境耐受性。研究发现立方体ag2o具有漆酶活性，并构建了检测马拉硫磷的比色传感体系。漆酶模拟物能够催化反应体系中的氧转化为水，不会造成环境的二次污染，是一种绿色的催化剂。但上述方法均是在溶液体系中进行其容易受到溶液ph值、高盐浓度、及溶液温度等的影响，限制了立方体ag2o在食品检测领域运用范围。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是现有氨基甲酸乙酯的检测方法受设备限制的问题。本发明的目的在于，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的基于氧化银漆酶活性的氨基甲酸乙酯(ec)比色检测方法。本方法以立方体ag2o作为信号载体，ec1-34核酸适配体作为信号识别分子，并将ag2o-ec1-34识别探针固定在纸片上制成比色纳米酶片；本方法整个检测过程以纸片作为载体，通过ag2o-ec1-34识别探针结合2,4-二氯苯酚(2,4-dp)和4-氨基安替吡啉(4-aap)，不需要任何的接枝与修饰，实现对氨基甲酸乙酯进行快速检测和现场监测。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：基于氧化银漆酶活性比色检测ec的方法：采用固定有ag2o-ec1-34识别探针的比色纳米酶片检测ec，通过ec1-34核酸适配体调控立方体氧化银的漆酶活性，同时结合ec1-34核酸适配体的特异性识别作用，实现氨基甲酸乙酯的比色快检。

3、上述比色纳米酶片的制备方法为：将立方体ag2o和ec1-34核酸适配体混匀后再加入超纯水在37℃条件下孵育10min，制备成ag2o-ec1-34识别探针，随后将4μl的ag2o-ec1-34识别探针固定在纸片上，制备得到比色纳米酶片。

4、进一步的是，上述比色纳米酶片的制备方法中，立方体ag2o、ec1-34核酸适配体和超纯水的体积比为5μl∶4μl∶17μl；其中，立方体ag2o的浓度为2mg/ml，ec1-34核酸适配体的浓度为10μm，ec1-34核酸适配体的序列为：5′-accgaccgtgctggactctgg gggcacgggaggt-3′。

5、上述基于氧化银漆酶活性比色检测ec的方法，具体包括如下步骤：

6、a.绘制ec浓度与颜色强度变化量的标准曲线，根据标准曲线建立线性回归方程；

7、b.采用比色纳米酶片检测待测液并得到颜色强度，计算待测液与空白对照组的颜色强度差值，将该颜色强度差值代入线性回归方程中，即可获得待测液中ec的浓度。

8、上述比色法检测ec的方法，步骤a中，绘制标准曲线的具体方法为：

9、a1.在比色纳米酶片上加入已知浓度的ec标准液，反应一定时间后，加入hepes缓冲液、2,4-dp溶液和底物4-aap制备得到待测组，为a1品；

10、a2.在比色纳米酶片上加入超纯水、hepes缓冲液、2,4-dp溶液和4-aap制备得到空白对照组，为a2品；

11、a3.取a1品和a2品，分别用软件处理得到区域颜色强度；

12、a4.根据颜色强度，将不同浓度的a1品与a2品之间的颜色强度差值作为纵坐标，氨基甲酸乙酯浓度作为横坐标绘制得到ec浓度与颜色强度变化量的标准曲线。

13、进一步的是，上述绘制标准曲线的具体方法，步骤a1、a2中，ec标准液/超纯水∶hepes缓冲液∶2,4-dp溶液∶4-aap的体积比为10μl∶5μl∶7μl∶5μl；步骤a1中，反应时间为10min。

14、进一步的是，上述绘制标准曲线的具体方法，步骤a1、a2中，hepes缓冲液的浓度为15mm，ph为7.5；2,4-dp溶液的浓度为4mg/ml；4-aap溶液的浓度为1mg/ml。

15、上述比色法检测ec的方法，步骤a中，当ec浓度为10μg/l≤c≤200μg/l时，其浓度与颜色强度变化量之间相互关系的回归方程为：y＝1.09×10-3c+0.38(r2＝0.996)；其中，y为颜色强度差值＝含ec的待测品颜色强度-a2品的颜色强度。

16、上述比色法检测ec的方法，步骤b中，比色纳米酶片检测待测液的方法为在比色纳米酶片上加入未知浓度的ec待测液，反应一定时间后，加入hepes缓冲液、2,4-dp溶液和底物4-aap，处理酶片得到颜色强度。

17、进一步的是，步骤b中，ec待测液∶hepes缓冲液∶2,4-dp溶液∶4-aap的体积比为10μl∶5μl∶7μl∶5μl；其中，hepes缓冲液的浓度为15mm，ph为7.5；2,4-dp溶液的浓度为4mg/ml；4-aap溶液的浓度为1mg/ml；反应时间为10min。

18、本发明的有益效果是：与现有技术相比，立方体ag2o具有优异的漆酶活性，由于其良好的物理、化学、电子特性而被广泛运用。考虑到该材料具有良好的催化活性、稳定性和环境耐受性，立方体ag2o近年来也被用于生物分析和食品安全检测。而本技术的发明人发现ec1-34核酸适配体序列可以增强立方体ag2o的漆酶活性，同时结合核酸适配体(ec1-34)特异性识别作用，构建了一种新型的ec快检方法。本技术的发明人将立方体ag2o和ec1-34制备的复合探针固定在纸片上，成功研发出ec比色纳米酶片。该漆酶快检纳米酶片弥补了过氧化物酶比色纳米酶片使用过氧化氢(h2o2)不稳定的缺陷。该快检酶片具有操作简便、显色时间短、成本低廉、选择性好等优势，并且可通过肉眼进行检测结果判断。

19、本技术制备的纳米酶片平均回收率在96.5％-101.3％以内，相对标准差(rsd)范围为2.24％-4.26％，其检测性能与高效液相色谱法(hplc)分析结果相似。该方法在天冬氨酸(asp)、脯氨酸(pro)、酪氨酸(tyr)、甘氨酸(gly)、谷氨酸(glu)、氨基甲酸甲酯(mc)，甲酰胺(prop)、西维因(cbr)、克百威(cbf)、多菌灵(cbz)等干扰性可以特异性地检测氨基甲酸乙酯(如图4所示)。本发明所提出的快速检测方法及酶片具有低成本、操作简单，可以通过替换相应的适配体扩展到检测其他感兴趣的目标。