一种基于免疫层析法的脂联素快速检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生化检测试剂，具体涉及利用免疫层析法快速检测脂联素抗原的试纸。

背景技术：

1、脂联素(adiponectin，adp/adpn)是由脂肪细胞特异性分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，大量存在于血液循环中，约占人血浆总蛋白的0.01％。脂联素由244个氨基酸组成，其基因位于染色体3q27，在调节胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢的过程中发挥重要作用。一方面，脂联素具有增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗的作用；另一方面，脂联素水平与糖尿病发生风险呈负相关，低脂联素水平个体发生2型糖尿病(t2dm)的风险是正常水平个体的9.32倍(plasma adiponectin levels and type 2diabetes risk:a nestedcase-control study in a chinese population and an updated meta-analysis.scirep.2018jan10；8(1):406.)。

2、2022年《糖尿病高危人群筛查及干预专家共识》推荐以脂联素为代表的生物标志物检测作为糖尿病风险筛查的手段，并推荐将脂联素水平作为干预疗效评价指标之一，形成连续动态的糖尿病风险管理模式(《糖尿病高危人群筛查及干预专家共识》解读.中国实用内科杂志,2022,42(02):113-123.)。不同于血糖和糖化血红蛋白这两个糖尿病诊断指标，脂联素是2型糖尿病的风险预测指标，通过脂联素可筛查出血糖尚且正常，但机体生理代谢已经出现异常的糖尿病(如2型糖尿病)高风险人群，脂联素可动态反映机体的胰岛素抵抗水平，与个体代谢健康息息相关。

3、目前脂联素检测产品主要是采用胶乳免疫比浊法、化学发光免疫分析法、磁微粒化学发光法等进行脂联素抗原检测，其中，胶乳免疫比浊法灵敏度、精确性均较高，但需特定的分析仪器、试剂价格高，增加了使用成本；化学发光免疫分析法检测时间长，需要对标准品进行不同程度的稀释，过程繁琐，同时要做到准确定量，对操作人员要求较高，需使用相应的分析仪器，无法做到床旁快速检测；磁微粒化学发光法具有灵敏度高、检测结果稳定等优点，但是选择性差、准确性不高，且环境对检测影响较大，容易导致误差。

4、鉴于脂联素具有的抗原属性且正常范围在5～30mg/l，中国专利cn207992242u采用荧光微球标记的脂联素鼠单克隆抗体与鼠抗脂联素抗体、兔抗鼠抗体，经pbs和/或含有牛血清白蛋白(bsa)的tris缓冲液(ph 6.5～6.7)稀释后制备了能够通过比色(定标卡对应的脂联素浓度：0.5、1、2、4、10、20、40mg/l)检测脂联素水平的荧光免疫层析试纸条，但该专利忽视了抗原抗体的非特异性结合、测试带抗体和控制带抗体在同一层析介质上反应等可能因素导致的显色信号的偏差及其对检测结果判读的影响。而中国专利cn216696335u利用dnp-bsa构建第一adp单抗-dnp-bsa-荧光胶乳微粒耦合物，并采用含吐温-20、bsa、蔗糖的pb对该耦合物进行稀释(另外还使用了第二adp单抗及兔抗dnp抗体)，从而制备了一种可以定量检测脂联素的荧光免疫层析试纸条，但该专利中的试纸条在经过校准后主要是用于检测正常范围内的脂联素。此外这些专利的检测结果获得依赖于分析仪器，不利于进行脂联素相关代谢生理变化的实时监测与评估。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于免疫层析法的脂联素快速检测试剂盒，可以在无需借助任何分析仪器的情况下，通过试纸快速、直接定性检测人血液脂联素，检测结果可以用于评估2型糖尿病的发生风险。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、第一方面，提供一种免疫层析法快速检测脂联素试纸(如试纸条、试纸卡)，该试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫、金标垫、检测反应区以及吸水垫，所述检测反应区包括检测带和质控带；金标垫包括利用碱性工作液负载在相应层析介质(即用于制备金标垫的层析介质)上的脂联素抗体i-胶体金标记物，检测带包括脂联素抗体ii，质控带包括抗脂联素抗体i的抗体(即能够与脂联素抗体i结合形成免疫复合物的抗体)，检测带处的脂联素抗体ii的包被浓度为质控带处的抗脂联素抗体i的抗体的包被浓度的1.9～2.1倍。

4、其中，所述脂联素抗体i、脂联素抗体ii均为抗人脂联素抗体(可以通过自制或购买获得)，这两个抗人脂联素抗体是针对脂联素这一抗原产生的具有不同的结合区或表位的抗体，且差异表位或结合区经识别后允许所述脂联素抗体i、脂联素抗体ii同时结合至该抗原。

5、优选的，所述脂联素抗体i为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源抗人脂联素抗原的多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种，如具体选择一种鼠抗人脂联素单克隆抗体(记为鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰ)。

6、优选的，所述脂联素抗体ii为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源抗人脂联素抗原的多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种，如具体选择另一种鼠抗人脂联素单克隆抗体(记为鼠抗人脂联素单克隆抗体ii)。

7、优选的，所述抗脂联素抗体i的抗体为羊抗鼠单克隆抗体。

8、优选的，所述金标垫还包括玻璃纤维膜或聚脂膜，所述脂联素抗体i-胶体金标记物铺放并吸附在该玻璃纤维膜或聚脂膜上。

9、优选的，所述铺放具体是通过将脂联素抗体i-胶体金标记物与复溶缓冲液混合后分散(如通过涂覆)在玻璃纤维膜或聚脂膜上而实现的；其中，复溶缓冲液为含有bsa和三羟甲基氨基甲烷(tris)的碱性溶液。

10、优选的，所述检测反应区还包括硝酸纤维素膜(nc膜)，所述脂联素抗体ii和抗脂联素抗体i的抗体包被在该硝酸纤维素膜上。

11、上述免疫层析法快速检测脂联素试纸的制备方法，包括以下步骤：

12、步骤1金标垫的制备

13、利用胶体金溶液对脂联素抗体i进行标记处理，得胶体金标记物(即脂联素抗体i-胶体金标记物)，将该胶体金标记物与所述复溶缓冲液混合，将所得复溶液作为胶体金标记物工作液(即上述碱性工作液)涂覆在玻璃纤维膜或聚脂膜上后干燥，备用；

14、步骤2检测反应区的制备

15、将脂联素抗体ii溶液(即用于包被脂联素抗体ii的工作液)和抗脂联素抗体i的抗体溶液(即用于包被抗脂联素抗体i的抗体的工作液)分别涂覆在硝酸纤维素膜上的两个不同区域后进行干燥，得到检测带和质控带，备用；

16、步骤3将样品垫、金标垫、检测反应区以及吸水垫依次安装在底板(如pvc板)上，然后按试纸(如试纸条、试纸卡)规格切割。

17、优选的，所述步骤1中，复溶液的制备方法具体包括以下步骤：将2～200ml胶体金溶液(粒径10～100nm)用0.03～0.3m的碳酸钾溶液调节ph到5.5～7.0后与50～100μg脂联素抗体i(如所述鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰ)混匀，然后于10～30℃反应10～30分钟，然后在反应体系中加入bsa至终浓度0.5％～1％(g/ml)，然后于10～30℃反应5～10分钟，然后在1000～12000rpm下离心5～30分钟，收集沉淀，得胶体金标记物；将胶体金标记物用该胶体金标记物体积1～10倍的复溶缓冲液稀释(即将胶体金标记物稀释1～10倍)。

18、优选的，所述复溶缓冲液具体包括：0.65～0.95m nacl、16.05～16.35mm kcl、47.5～52.5mm tris和质量分数0.1％～0.5％ bsa，复溶缓冲液的ph为8.0。

19、优选的，所述步骤1中，涂覆的条件包括：将复溶液按照40～80μl/cm2喷涂于玻璃纤维膜或聚脂膜上；干燥的条件为：35～40℃下18～24小时。

20、优选的，所述步骤2中，涂覆采用的脂联素抗体ii(如所述鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰi)溶液、抗脂联素抗体i的抗体(如所述羊抗鼠单克隆抗体)溶液的浓度分别为0.5～4mg/ml，溶剂均为0.05～0.3m pbs(ph 6.0～7.5)；干燥的条件为：35～40℃下18～24小时。

21、优选的，所述步骤1及步骤2中，涂覆的条件还包括：10～30℃、湿度≤30％。

22、第二方面，提供一种脂联素的检测试剂盒，该试剂盒包括上述免疫层析法快速检测脂联素试纸。

23、优选的，所述试剂盒还包括样本处理的试剂等。

24、第三方面，提供一种脂联素的检测方法，该检测方法包括以下步骤：

25、利用上述免疫层析法快速检测脂联素试纸对样本进行检测。

26、优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：

27、步骤1样本处理

28、取采集的血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释≤100倍，其中加样缓冲液为水、或含质量分数0.85％～0.9％氯化钠的0.05～0.3m磷酸盐缓冲液(pbs，ph 6.0～7.5)、或含质量分数0.85％～0.9％氯化钠的0.05～0.2m硼酸盐缓冲液；

29、步骤2将经过处理后的血清、血浆或全血样本稀释液50～100μl加到所述试纸的样品垫上，10～30℃静置5～20分钟，观察所述试纸的检测带和质控带的颜色；

30、步骤3结果判读

31、检测带显色浅于质控带，说明样本脂联素浓度低于临界值，即检出阳性样本；检测带显色强于质控带或检测带显色与质控带显色相当，说明样本脂联素浓度高于或等于临界值，即检出阴性样本；质控带不显色，说明所述试纸失效。

32、优选的，所述临界值为5mg/l(即5μg/ml)。

33、优选的，所述样本的采集包括以下步骤：

34、血清样本：取全血1～5ml于血清采集管中，10～30℃静置1～2小时，3000～5000rpm离心10～30分钟，取上清即得。

35、血浆样本：取全血1～5ml于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中，1000～3000rpm离心10～30分钟，取上清即得。

36、全血样本：取指尖或耳垂新鲜血10～100μl，即得。

37、本发明的有益效果体现在：

38、本发明将免疫层析应用于脂联素的检测试纸，通过将制备金标垫的工作液改为碱性体系以及控制检测带与质控带的包被物比例，使得检测试剂盒无需借助任何分析仪器，在现场获取样本和进行加样，即可快速、直接定性检测人血液脂联素，并且依照检测结果可以判定样本脂联素含量与预设临界值的相对水平。本发明的检测试剂盒不仅使用方便快捷、成本低廉，而且检测的准确性、安全性(如可以通过指尖采血)和灵敏性较高，适合于医院、疾控、基层卫生单位检测及家庭自测，满足对人体产生的脂联素抗原进行实时监测的需求，在2型糖尿病预防风险预测等方面具有应用价值，适于推广。

39、进一步的，本发明以鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰ和鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰi为双抗体，其中鼠抗人脂联素单克隆抗体ⅰ经过胶体金纳米颗粒标记后用于在金标垫处捕获样本中的脂联素抗原，鼠抗人脂联素单克隆抗体ii则用于在检测带处对捕获的脂联素抗原进行固定(显色)，即获得了基于双抗夹心法的脂联素快速检测试纸，可以使用极少量血液样本完成检测，能够提高脂联素的检测效率。

40、进一步的，本发明通过对标记后抗体复溶条件的优化，使得最终形成的金标垫可以很好地消除非特异性结合(如通过将pbs替换为含有tris的相应复溶缓冲液，减少乃至避免了金标垫上游离的胶体金纳米颗粒引起的检测带显色)。

41、进一步的，本发明通过在制备金标垫时，对复溶缓冲液中tris的浓度进行优化，并确定最适的复溶缓冲液成分配比，可有效避免样本检测过程中假阴性显色的出现，提高了检测结果的准确性与可靠性。