一种直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的物质分析方法和装置

本发明属于生物技术和生物医学领域，尤其涉及一种直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的物质分析方法和装置。

背景技术：

1、数字微流控技术，是一种基于离散液滴操作的微流控技术。在数字微流控芯片上，液体被分割成离散的微升级液滴，并通过操纵电场、机械作用力或温度等方法对液滴进行精准定位和操作。其中，基于介电润湿数字微流控是利用介电效应控制微流体液滴的位置、合并、分离和移动一种技术。其原理是通过在微通道表面施加交变电场，改变流体的介电常数和表面润湿性，从而实现对微流体的精确操控。由于其独特优势(如高精度、可编程性、快速响应和实时控制)，基于介电润湿的电操控数字微流控技术已广泛应用于生物学和化学分析等领域。它可以用于样品混合、反应控制、细胞操作、酶反应、基因分析等各种实验操作。在质谱分析之前的化学和生物反应(如细胞裂解和蛋白质提取)中，数字微流控技术的高精度、高灵活性和自动化特点为实验操作提供了新的可能性，有助于提高实验效率和减少试剂浪费。

2、质谱是一种化学分析技术，可用于分析化合物的分子结构和组成。其原理是通过分析离子在电磁场中的运动轨迹和质量电荷比来确定化合物的分子量和结构。其中，基质辅助激光解吸电离质谱是最常用的激光解吸电离质谱方法之一。该质谱法将分析物与一种吸收并将激光能量转移到分析物上的基质液共结晶形成离子化合物。这些离子化合物通过电场加速被检测器捕获并分析。基质辅助激光解吸电离质谱具有纳秒级快速分析、高灵敏度和高通量优势，目前已被用于分析生物样本的蛋白质和细菌鉴定，以及生物标志物和代谢物检测。

3、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在微生物鉴定领域取得了显著成绩，特别是临床微生物检验。这一技术以其简单操作、高准确性、高通量、快速鉴定、丰富数据库资源和低成本等优势，在全球微生物实验室得到广泛应用。相比传统的微生物鉴定方法，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱能够大幅缩短鉴定时间，为细菌和真菌的准确快速鉴定提供了有力支撑，对提高临床诊断和治疗效率具有重要意义。基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的微生物数据库已成为临床鉴定细菌的常用方法，将鉴定时间缩短到分钟。该数据库包含4000多株菌株，在物种水平上的准确率为90％。

4、然而，目前大多数研究中将微流控系统与基质辅助激光解析电离质谱两套独立完整系统的联用时，需要在质谱分析之前手动将样品转移到基质辅助激光解析电离质谱的靶板上实现离线分析。即使在使用微流控装置准备样品阵列的情况下，质谱表面也需要手动从微流控装置中再转移到质谱系统中。因此，如何实现无需人工干预即可使用基质辅助激光解析电离质谱进行微流控整合完成样品的在线分析是当前面临的主要问题。为了实现两者的在线分析，现有的微流控和基质辅助激光解析电离质谱联用装置的设计思路是加工设计固定微流道实现连续液滴的操纵，但此种设计的技术难度和加工工艺无疑是复杂的。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的物质分析方法和装置，将设有亲水位点的上板和定制靶板直接耦合后送入质谱仪，可减少手工操作，实现自动化分析，该方法具有高通量、灵敏度和特异性分析的潜力。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析装置，包括：

4、数字微流控系统，包括数字微流控芯片和微液滴驱动平台；所述数字微流控芯片包括上板、下板和二者之间的导电垫片，所述上板包括上基板和设置于所述上基板下表面的导电层，所述导电层的下表面设有上疏水层，所述上疏水层的表面间隔布置有若干个亲水位点，每个所述亲水位点为向导电层方向内陷的凹坑；所述下板包括下基板和设置于下基板上表面的介电层，所述下基板和所述介电层之间布置有电极阵列，所述介电层的上表面设有下疏水层；

5、基质辅助激光解析电离质谱，包括靶板基板，所述靶板基板的上表面设有与用于放置所述数字微流控芯片的上板的凹槽。

6、上述的直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析装置中，每个所述凹坑的深度为49～51微米；

7、每个所述凹坑的横向面积为4～16mm 2。

8、上述的直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析装置中，在制备所述上板时，在所述导电层的下表面形成所述上疏水层前用覆盖片固定在所述导电层的下表面预先设计的亲水位点处，在形成所述上疏水层后剥离所述覆盖片，以在所述覆盖片处形成所述凹坑；

9、所述上疏水层的材质为聚四氟乙烯，通过旋涂在所述导电层的下表面制作所述上疏水层；

10、所述覆盖片的材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)。

11、上述的直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析装置中，所述电极阵列包括储液池电极、驱动电极、地电极和接触电极；多个储液池电极排布成二维阵列构成二维储液池电极阵列，二维储液池电极阵列中有空隙，二维储液池电极阵列的空隙中设置有多个驱动电极，并且每一个储液池电极的边缘均通过相应的驱动电极连接至位于二维储液池电极阵列空隙中的驱动电极，每一个储液池电极、驱动电极和地电极分别连接至一个接触电极，并通过接触电极连接至所述微液滴驱动平台；地电极接地；所述上板中的导电层通过所述导电垫片连接至所述地电极。

12、上述的直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析装置中，若干所述亲水位点位于所述驱动电极在上板中的对应位置处。

13、第二方面，本发明提供一种直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析方法，采用上述任一项所述的分析装置，包括如下步骤：

14、使包含待测样品和基质液的液滴在所述微流控芯片的亲水位点处附着于上板，将上板置于所述靶板的凹槽中且亲水位点朝向凹槽外，送入所述基质辅助激光解析电离质谱中进行分析。

15、上述的直接集成数字微流控芯片和基质辅助激光解析电离质谱的分析方法中，所述待测样品为细菌、维拉帕米或胰岛素；

16、所述基质液为包含2,5-二羟基苯甲酸的溶液或包含α-氰基-4-羟基肉桂酸的溶液。

17、作为实例，当对维拉帕米溶液进行定量分析时，在所述数字微流控芯片上板的亲水位点处分别混合基质液与不同浓度的维拉帕米溶液；

18、优选地，所述基质液由2,5-二羟基苯甲酸、乙腈、去离子水和三氟乙酸组成，2,5-二羟基苯甲酸浓度为20mg/ml、乙腈、去离子水和三氟乙酸的体积比为50％：47.5％：2.5％；所述基质液与维拉帕米溶液的体积比为1：1，每个浓度滴加3次样品，每次1μl，每个样品激光5次，收集数据求平均值；所述基质辅助激光解吸电离质谱机器参数设计如下：电压10.5x，激光频率1000hz，激光强度100％，方法lp_700-2000_da。

19、作为实例，当对大肠杆菌进行指纹图谱鉴定时，在所述数字微流控芯片上板的亲水位点处混合大肠杆菌、裂解液和基质液；

20、优选地，所述裂解液为体积分数为70％的甲酸水溶液，所述基质液为浓度为10mg/ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液、溶剂由体积百分比为50％：47.5％：2.5％的乙腈、去离子水和三氟乙酸组成，每单个大肠杆菌的单菌落滴加1微升所述裂解液和1微升所述基质液；每个样品接种3样，每次接种单个大肠杆菌菌落，每个样品激光5次，收集数据求平均值；基质辅助激光解吸电离质谱机器参数设计如下：电压10x，激光频率1000hz，激光强度100％，方法mbt_pc。

21、作为实例，进一步地，按照如下步骤混合大肠杆菌、裂解液和基质液：a)将大肠杆菌的样本溶液和裂解液分别滴入所述数字微流控芯片中，控制芯片分别使两种液滴进行分裂，将两种分裂后的液滴混合后移动至所述微流控芯片中上板的亲水位点处；b)将基质液滴入数字微流控芯片，控制芯片使液滴分裂，将液滴移动至所述微流控芯片中上板的亲水位点处，与步骤a)中液滴汇合。

22、基于以上技术方案，本发明具有如下有益效果：

23、本发明将数字微流控芯片与基质辅助激光解析电离质谱直接集成，将二者优势结合，实现自动化和高通量、快速操作、低样本消耗、准确分析等目标。

24、(1)自动化和高通量：微流控技术与质谱的直接耦合可以实现自动化的样品处理和分析，以及高通量的操作。使用时移液枪针对不同电极注入样本和溶剂，芯片通过编程控制液滴的运动和操作流程，实现自动化的生物样本预处理，提高实验的重复性、稳定性和处理样品数量。将上板和定制靶板直接耦合后送入质谱仪，减少手工操作，实现自动化分析。相比于现有技术，本发明通过离散液滴芯片和靶板设计可以针对不同微量样本实现灵活动态处理，在设备使用效率和处理复杂样本上具有应用潜力。

25、(2)快速操作：微流控技术具有快速响应和实时控制的特点，通过施加电场或机械作用力，可以快速操纵液滴位置和运动。这样可以大大缩短样品预处理时间，提高操作效率。快速操作还可以减少样本的损失和变化，提高结果的一致性和可重复性。

26、(3)低样本消耗：微流控技术在样本处理方面具有小样本量和试剂节约的优势。通过微流控芯片的液滴操作模块，可以将微量样本与试剂精确混合，减少了样本和试剂的消耗。这对于稀有样本或昂贵试剂的研究尤为重要，不仅节省了成本，还可以最大限度地利用有限的样本资源。

27、(4)准确分析：基质辅助激光解吸电离质谱离子化均匀，离子化碎片只带有单一电荷。高灵敏度、高分辨率、高分析速度、高特异性和高重现性，测定质量范围广。