抗缪勒管激素在提高体外培养卵母细胞质量中的应用及培养方法

本发明属于动物繁殖，具体涉及抗缪勒管激素在提高体外培养卵母细胞质量中的应用及培养方法。

背景技术：

1、牛业作为我国畜牧业的重要组成部分，是肉类和乳制品等重要食品的来源。随着我国经济的快速发展和人民生活水平的提高，人们对牛肉和牛奶的需求量日益增长。目前，现有牛业尚存在良种覆盖率低、良种培育速度慢等瓶颈问题，制约了牛肉和牛奶产量和品质提升。

2、体外胚胎生产(ivp)是加快母牛良种繁育的有效途径。牛的体外胚胎生产技术涵盖了卵母细胞的体外成熟(ivm)、体外受精(ivf)和胚胎的体外培养(ivc)等过程。其中，卵母细胞体外成熟是首要环节，其成熟质量的优劣直接决定着受精和胚胎发育的成败。在卵母细胞发育的过程中，核成熟是卵母细胞准确分配染色体的基础，而胞质成熟是卵母细胞具备高发育潜能的关键。卵母细胞的胞质成熟主要涉及：mrna、蛋白质和脂质等物质的储备，细胞器的重新分布，细胞器功能和抗氧化能力等。卵母细胞的核成熟和胞质成熟在体内是同步的。然而，在体外卵母细胞与卵泡分离后导致微环境内camp的浓度骤然降低，卵母细胞自发恢复减数分裂进程，容易出现核-质成熟不同步的现象，导致体外成熟的卵母细胞发育潜能降低。因此，提高体外培养卵母细胞质量是增加胚胎产出和质量的重要保障。

3、抗缪勒管激素(anti-müllerian hormone，amh)与其他tgf-β超家族成员相似，是由2个单体通过二硫键连接形成的二聚体糖蛋白，大小为140kda，每条单体分为n端结构域和c端结构域，c端为活性作用端。在哺乳动物卵巢中，amh由颗粒细胞产生，其表达水平取决于卵泡的不同发育阶段。amh在原始卵泡中没有表达，在初级卵泡中开始合成，在小有腔卵泡中达到最高水平。目前尚未见有关amh用于提高牛卵母细胞体外成熟质量的报道。基于此，本发明旨在提供一种新型的牛卵母细胞体外成熟培养方法，对提高牛以及其它动物体外胚胎生产效率、加快良种扩繁具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供抗缪勒管激素的一个新用途。本发明的另一个目的在于提供一种卵母细胞体外成熟培养液。

2、本发明的第三个目的在于提供一种提高牛卵母细胞体外成熟质量的培养方法。

3、为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

4、抗缪勒管激素在提高体外培养卵母细胞质量中的应用。进一步地，应用是将卵母细胞在含抗缪勒管激素的体外培养液中进行培养，所述抗缪勒管激素在体外培养液中的浓度为50～150ng/ml。

5、如上所述的应用，优选地，所述卵母细胞为牛卵母细胞、鼠卵母细胞、猪卵母细胞、人卵母细胞或羊卵母细胞。

6、抗缪勒管激素在制备卵母细胞体外培养液中的应用。

7、一种卵母细胞体外成熟培养液，其含有抗缪勒管激素。

8、如上所述的卵母细胞体外成熟培养液，优选地，所述抗缪勒管激素在卵母细胞体外成熟培养液中的浓度为50～150ng/ml。

9、进一步优选地，所述抗缪勒管激素在卵母细胞体外成熟培养液中的浓度为100ng/ml。

10、如上所述的卵母细胞体外成熟培养液，优选地，所述卵母细胞体外成熟培养液以m199培养液为基础，还含有体积分数为10％的胎牛血清、1％的青霉素和链霉素混合液、1％的100×glutamax(l-谷氨酰胺)、0.2mm丙酮酸钠、50ng/ml表皮生长因子(egf)、0.05iu/ml促卵泡生成素(fsh)。

11、一种提高体外培养卵母细胞质量的方法，其是将卵母细胞加入到如上所述的卵母细胞体外成熟培养液进行培养。

12、如上所述的方法，优选地，所述卵母细胞为牛卵母细胞、鼠卵母细胞、猪卵母细胞、人卵母细胞或羊卵母细胞；

13、培养前，卵母细胞体外成熟培养液需在38.5℃、5％co2饱和湿度的培养箱中预平衡3～4h；培养为置于38.5℃、5％co2饱和湿度的培养箱中，培养18～24h。

14、进一步地，所述卵母细胞为牛gv期卵母细胞，具有3层及以上卵丘细胞包裹且胞质颜色均匀。

15、进一步地，每50μl卵母细胞体外成熟培养液可培养10枚牛卵母细胞，以提高培养效果。

16、本发明的有益效果在于：

17、本发明提供了抗缪勒管激素的新用途，可有效提高卵母细胞在体外培养时的质量，表现为显著增加牛卵母细胞脂质、mrna和蛋白质的储备，提高卵母细胞线粒体功能和抗氧化能力，促进线粒体和皮质颗粒的正确分布，进而提升卵母细胞成熟质量，提高卵母细胞的发育潜能。

18、本发明还提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的培养方法，在不影响牛卵母细胞核成熟的情况下，有效促进了牛卵母细胞的胞质成熟。该培养液通过添加amh，显著提高牛成熟卵母细胞储存脂质、mrna和蛋白质的能力，促进细胞器的重新排列，并进一步提高线粒体膜电位、线粒体dna(mt-dna)拷贝数、atp水平等线粒体功能和抗氧化能力，从而改善牛卵母细胞体外成熟质量，并有效提升其发育潜能。

19、本发明提出的牛卵母细胞体外成熟培养方法，其操作简单，成本低廉，仅需要基础的细胞培养箱、体式显微镜、恒温加热器和市售的试剂耗材，可以有效地提高体外成熟后牛卵母细胞的质量，培养效果优异且稳定，适合推广。并为完善动物卵母细胞体外成熟技术体系提供新思路，对提高动物体外胚胎生产效率、助力畜牧业种业振兴具有重要意义。

技术特征：

1.抗缪勒管激素在提高体外培养卵母细胞质量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用是将卵母细胞在含抗缪勒管激素的体外培养液中进行培养，所述抗缪勒管激素在体外培养液中的浓度为50～150ng/ml。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卵母细胞为牛卵母细胞、鼠卵母细胞、猪卵母细胞、人卵母细胞或羊卵母细胞。

4.抗缪勒管激素在制备卵母细胞体外培养液中的应用。

5.一种卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，其含有抗缪勒管激素。

6.根据权利要求5所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述抗缪勒管激素在卵母细胞体外成熟培养液中的浓度为50～150ng/ml。

7.根据权利要求5所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述抗缪勒管激素在卵母细胞体外成熟培养液中的浓度为100ng/ml。

8.根据权利要求5～7任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述卵母细胞体外成熟培养液以m199培养液为基础，还含有体积分数为10％的胎牛血清、1％的青霉素和链霉素混合液、1％的100×glutamax、0.2mm丙酮酸钠、50ng/ml表皮生长因子、0.05iu/ml促卵泡生成素。

9.一种提高体外培养卵母细胞质量的方法，其特征在于，其是将卵母细胞加入到权利要求5-8中任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液进行培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述卵母细胞为牛卵母细胞、鼠卵母细胞、猪卵母细胞、人卵母细胞或羊卵母细胞；

技术总结本发明提供了抗缪勒管激素在提高体外培养卵母细胞质量中的应用，具体是将卵母细胞在含抗缪勒管激素的体外培养液中进行培养，能显著增加卵母细胞脂质、mRNA和蛋白质的储备，提高卵母细胞线粒体功能和抗氧化能力，促进线粒体和皮质颗粒的正确分布，进而提升卵母细胞成熟质量，提高卵母细胞的发育潜能。本发明还提供了能提高牛卵母细胞体外成熟质量的培养液及培养方法，其操作简单，成本低廉。本发明发现了AMH调控牛卵母细胞的新功能，为完善家畜卵母细胞体外成熟技术体系提供新思路，对提高家畜体外胚胎生产效率、助力家畜种业振兴具有重要意义。技术研发人员：梁爱心,柳明晓,郑小雪,孙培皓,杨利国,周硕,程宁娜,周济受保护的技术使用者：华中农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/12